康砖茶叶风味特征及挥发性成分分析

张 婷，倪 辉,2,，伍 菱,2，胡 阳,2，邬应龙，黄高凌,2，李利君,2

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室， 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021；3.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）

茶叶是一类重要的农产品，根据茶叶原料品种和加工过程的不同，将茶叶分为六大类：绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶和黑茶[1]。香气是决定茶叶品质的关键因素之一[2]，阐明茶叶香气特征是提高茶叶产品质量的重要研究内容。目前，香气提取方法有超临界流体萃取法、同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）法、顶空吸附法、吹扫捕集法以及固相微萃取法等[3]。其中，SDE法具有重复性好和效率高等优点[4]。此外，香气化合物的分析检测方法主要有气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术和气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术等，能实现多组分挥发性化合物的定性和定量分析及确定样品中产生的关键香气成分[5-6]。 自1893年Bamber用蒸馏法提取茶叶中的香精油开始，迄今已从茶叶中分离出包括醇、醛、酮、酯、酸、氮、氧杂环化合物等在内的700 多种香气物质[7-8]。

黑茶是一类特殊的微生物后发酵茶，其生产和消费主要集中在中国和日本[9]。我国黑茶主要包括云南普洱茶、湖南茯砖茶、广西六堡茶、湖北青砖茶和四川康砖茶[10]。在黑茶的香气研究方面，相关学者利用SDE法结合GC-MS技术测定了茯砖茶主要挥发性成分为月桂烯、1-辛醇和月桂酸甲酯等18 种物质[11]。此外，刘泽森等[12]从槟榔香六堡茶中鉴定出66 种挥发性成分，且发现α-雪松醇、β-雪松烯、l,2,3-三甲氧基苯、β-芳樟醇和氧化芳樟醇是其主要挥发性成分；陈梅春等[13]采用顶空固相微萃取-GC-MS联用法分析陈年普洱茶的挥发性成分，发现主要以高沸点的芳烃类及其衍生物和萜烯类化合物为主；郑鹏程等[14]研究康砖茶叶主要挥发性成分为己醛、α-紫罗酮、反式-香叶基丙酮和β-紫罗酮，并采用峰面积归一法对其挥发性成分定量分析。目前，已有许多学者研究黑茶的主要挥发性成分种类和含量，但是鲜有文献报道黑茶的香气特点及关键呈香化合物。

四川康砖茶（又称藏茶）是我国典型的黑茶代表之一，是藏族人民煮奶茶的生活必需品[15]。目前国内外学者已经开始研究四川康砖茶发酵的功能微生物，对其风味特征及关键香气成分尚未开展深入研究。因此，本研究的主要目的是综合感官评价、GC-MS及GC-O分析，解析康砖茶叶挥发性成分及风味特征，为进一步改善康砖茶叶的品质提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

康砖茶叶（2017年）主要工艺流程：以做庄茶为原料，进行蒸揉、渥堆、烘干、筛分、蒸压和干燥等，购于深圳东方高柏科技股份有限公司，购买后以锡箔袋密封，保存于4 ℃冰箱中备用。

正构烷烃（C8～C20）、环己酮 美国Sigma-Aldrich公司；己醛、庚醛、α-蒎烯、2-戊基呋喃、2-乙基己醇、苯乙醛、苯乙酮、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、芳樟醇、壬醛、苯乙醇、α-萜品醇、香叶醇、雪松醇、反式-2-壬烯醛、藏花醛、反式-α-紫罗兰酮、顺式-香叶基丙酮、反式-β-紫罗兰酮、吲哚、1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯 美国Alfa Aesar公司；无水硫酸钠 国药集团化学试剂有限公司；正己烷（色谱纯） 瑞典欧森巴克化学公司。

1.2 仪器与设备

SDE装置Likens-Nickerson仪器 郑州鑫瑞化验厂；电热套 邦西仪器科技（上海）有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-III循环真空泵 郑州长城科工贸有限公司；QP-2010 Plus GC-MS联用仪 日本岛津公司；Rtx-5MS和Rtx-WAX色谱柱 美国Restek公司；OP275嗅闻仪 日本GL Science公司。

1.3 方法

1.3.1 SDE法提取康砖茶叶挥发性成分

由于康砖茶叶在饮食时通常要经过长时间的煮茶，因此，用SDE法提取其挥发性成分，模拟沸水煮茶叶的工艺。准确称量30 g康砖茶叶于圆底烧瓶中，并加入300 mL超纯水，萃取剂为100 mL正己烷，将两个烧瓶放置于SDE装置中，并用电热套加热至各自的沸点，萃取时间1.5 h。萃取结束后，冷却至室温，用分液漏斗进行分离，收集的有机相用无水硫酸钠干燥24 h后，旋蒸浓缩至3 mL，再经高纯氮气吹至1 mL，得到浓缩的康砖茶叶提取物，密封放置-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 感官评价

参考相关文献[16-17]和ISO 8589—2007，首先采用少量乙醇稀释不同香气的标准品，然后量取一定体积的超纯水将标准品分别进行稀释成1、4、9 分对应的浓度，并建立康砖茶叶气味特征感官评价标准（表1），选取12 名感官评价成员（20～30 岁）包括8 名女性和4 名男性（均为培训6 个月以上感官评价的人员），区别青草香、花香、木香、甜香和陈旧味的香气特征和强度，其中1 分表示香气强度较低，4 分表示香气强度中等，9 分表示香气强度较高。在此基础之上取20 μL康砖茶叶提取物加入980 μL无水乙醇进行混匀稀释，并取50 μL稀释液滴在闻香条上，空气中干燥90 s进行感官评价。评价过程中，室温保持在（25±2）℃之间，相对湿度在50%～75%之间，室内无其他气体干扰并保持通风。

表 1 康砖茶叶感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Kangzhuan tea

1.3.3 色谱条件

Rtx-5MS石英毛细柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；升温程序：选择程序升温，进样口温度为230 ℃，初始温度为50 ℃并保持2 min，以3 ℃/min升温至200 ℃，保持1 min；载气（He）流速3 mL/min， 进样量1 μL；不分流进样。

R t x-W A X 石英毛细柱（3 0 m×0.3 2 m m，0.25 μm）；升温程序：选择程序升温，进样口温度为250 ℃，初始温度为50 ℃并保持3 min，以3 ℃/min升温至130 ℃，再以5 ℃/min升温至230 ℃，保持1 min；载气（He）流速3 mL/min，进样量1 μL；不分流进样。

1.3.4 质谱条件

Rtx-5MS石英毛细柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）和Rtx-WAX石英毛细柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）电离方式均为电子电离，电离能量均为70 eV，质谱接口温度分别为250 ℃和200 ℃；离子源温度分别为220 ℃和200 ℃，扫描方式选择Scan模式进行定性分析，离子碎片的扫描范围均为m/z 35～500；溶剂延迟时间均为1.5 min；定量分析时质谱扫描方式设为单离子扫描（single ion monitoring，SIM）模式。

1.3.5 挥发性成分的定性和定量分析

1.3.5.1 定性分析

运用质谱数据库（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）进行相似度检索，根据不同物质的基峰、质荷比和相对峰度做串连检索与人工解析，质谱匹配度大于80%作为物质鉴定标准。计算待测组分的保留指数（retention index，RI），与文献报道的保留指数进行对比定性，其中保留指数运算参照Vandendool等[18]的方法，将待测物质的特征离子和RIx与标准品比较进行定性。

式中：TR为保留时间；x为待测组分；n和n+1分别为待测组分出峰前后相邻的两个正构烷烃的碳原子数。

1.3.5.2 定量分析

具有标准品的挥发性成分，采用正己烷作为溶剂，并配制质量浓度梯度分别为0.5、1、5、10、50、80、100 μg/mL的混合标准品，按照1.3.3节和1.3.4节的GC-MS条件，并对混合标准品依次从低质量浓度到高质量浓度进行分析，进样量均为1 μL，之后建立标准曲线对康砖茶叶挥发性成分进行定量。

不具有标准品的挥发性成分，精确吸取990 μL康砖茶叶提取物并加入10 μL环己酮（10 μg/mL）作为内标物进行混匀，进样量为1 μL，之后采用内标法进行定量。

1.3.6 GC-MS-O条件

GC-MS的条件与1.3.3节描述的一致。嗅闻仪条件：以空气（21% O2和79% N2混合）为载气，流速 50 mL/min，加热线温度200 ℃，分流比1∶1。GC-O实验采用香气萃取稀释法分析康砖茶叶提取物的气味和强度，将提取物以正己烷为溶剂进行40、41、42、43倍稀释，进样针吸取每个稀释倍数的样品1 μL注射到GC进样口，由3 个经过闻香训练的人员进行嗅闻，并记录保留时间、香气特征和稀释倍数。每个样品重复3 次。

1.4 统计分析

通过Microsoft Office Excel 2010软件计算实验数据的均值和标准差，并绘制相关图表。

2 结果与分析

2.1 感官评价

康砖茶叶香气提取物感官评价的雷达图（图1）显示，其主要呈现花香和木香，其次是陈旧味和青草香以及轻微的甜香，这表明康砖茶叶的主要香气轮廓为花香和木香，该结果不同于相关文献报道普洱生茶和普洱熟茶主要以花香和陈旧味为主[19-20]，说明康砖茶叶与普洱茶的风味特征不同。

图 1 康砖茶叶感官评价雷达图Fig. 1 Radar map of sensory evaluation of Kangzhuan tea

2.2 挥发性成分的定性分析

对康砖茶叶进行GC-MS分析，得到该样品中挥发性成分的总离子流图（图2），根据谱库检索、标准品比对及参考相关文献，共鉴定出35 种挥发性成分（表2）， 包括8 种醇类、6 种醛类、8 种酮类、3 种萜烯类、4 种氧化物类以及6 种其他类化合物，该结果与郑鹏程等[14]报道康砖茶叶主要挥发性成分种类相似。但与黄亚辉等[11]报道的茯砖茶挥发性化合物主要是醇类和酯类物质具有明显不同，这表明康砖茶叶和其他黑茶品种的挥发性成分不同。

图 2 康砖茶叶中挥发性成分的总离子流图Fig. 2 Total ion current chromatograms of volatiles in Kangzhuan tea

表 2 康砖茶叶中挥发性成分鉴定结果Table 2 Identification of volatile compounds in Kangzhuan tea

2.3 挥发性成分的定量分析

表 3 康砖茶叶中挥发性成分的定量结果Table 3 Quantitation of volatile compounds in Kangzhuan tea

康砖茶叶挥发性成分经过标准曲线外标法进行定量（表3），可以得知醇类、醛类、酮类、萜烯类、氧化物类和其他类分别占挥发性成分总量的20.59%、9.96%、11.95%、3.49%、5.17%和48.83%，因此醇类、酮类和其他类在康砖茶叶提取物挥发性成分中相对含量较高，这与郑鹏程等[14]采用顶空固相微萃取结合GC-MS研究康砖茶叶中酮类和醛类的相对含量高于其他类成分相似。由表3还可看出，醇类物质中，含量较高的化合物为2-乙基己醇（37.7 μg/mL）、雪松醇（34.8 μg/mL）、α-萜品醇（14.4 μg/mL）和芳樟醇（11.9 μg/mL）。相关研究表明，这些物质主要是由于茶叶发酵过程中微生物产生的胞外酶水解糖苷类香气前体而生成[23]。

醛类物质中，苯乙醛（2 5.5 μ g/m L）、壬醛 （8.8 μg/mL）和己醛（8.4 μg/mL）是康砖茶叶含量较高的化合物。该类成分主要是不饱和脂肪酸的自动氧化和水解的产物[23]。此外，Xu Xiangjun等[23]发现茯砖茶中醛类的相对含量为51%，与之相比，本研究醛类物质相对含量（9.96%）明显低于茯砖茶。

酮类物质中，顺式-香叶基丙酮（20.2 μg/mL）、4-(2,4,4-三甲基-1,5-环己二烯-1-基)-3-丁烯-2-酮 （17.0 μg/mL）和6,10-二甲基-2-十一酮（6.2 μg/mL）为康砖茶叶含量较高的成分，这与Lv Shidong等[10]研究茯砖茶中含量较丰富的化合物为β-紫罗兰酮和香叶基丙酮基本一致。Mapari等[24]的研究认为该酮类物质是由于类胡萝卜素（植物烯或植物氟烯）发生氧化反应和缩合反应而生成的。

萜烯类物质中，主要包括花侧柏烯（10.0 μg/mL）、α-雪松烯（5.7 μg/mL）和α-蒎烯（3.6 μg/mL）三种化合物。此外，芳樟醇氧化物I（5.1 μg/mL）、芳樟醇氧化物II（2.1 μg/mL）、芳樟醇氧化物III（4.6 μg/mL）和芳樟醇氧化物IV（16.8 μg/mL）均在康砖茶叶中检测到。 Lv Shidong等[10]研究表明普洱茶和茯砖茶后发酵过程中，芳樟醇发生氧化作用而生成芳樟醇氧化物，从而导致芳樟醇含量急剧下降，且普洱茶和茯砖茶中芳樟醇氧化物相对含量分别为5.39%和3.77%。本研究结果与之相比，芳樟醇氧化物相对含量（5.17%）比茯砖茶的高，但比普洱茶略低，这表明不同品种的茶叶中芳樟醇氧化的程度是不同的。

1,2,3-三甲氧基苯（151.7 μg/mL）和二氢猕猴桃内酯（96.9 μg/mL）是康砖茶叶挥发性成分含量较高的化合物，分别占挥发性成分总量的27.43%和17.52%。这与有关学者研究二氢猕猴桃内酯是茯砖茶主要挥发性成分是一致的[10]。此外，Lv Haipeng等[19]指出1,2-二甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯和1,2,4-三甲氧基苯等化合物是由于微生物和热降解双重作用下，通过没食子酸的甲基化修饰而形成的。

2.4 挥发性成分的GC-O结果分析

将康砖茶叶提取物进行GC-O分析，从表4可知，共检测到24 种香气化合物，包括5 种醇类（FD值=26）、6 种醛类（FD值=102）、5 种酮类（FD值=89）、1 种萜烯类（FD值=1）、2 种氧化物类（FD值=20）和5 种其他类（FD值=17），该结果表明醛类、酮类和醇类为康砖茶叶主要香气贡献成分种类，这与青砖茶叶的香气贡献成分种类为醛类、酮类、芳香烃类和醇类的结果相似[25]。

表 4 康砖茶叶中香气成分GC-O结果Table 4 GC-O analysis of odor compounds in Kangzhuan tea

醇类物质中，芳樟醇（FD值=16）呈现花香且是茶叶中常见的挥发性成分，主要是由糖苷类前体水解 生成[26-28]，然而芳樟醇并不是含量最高的醇类物质却是香气强度较大的化合物，原因是该物质具有比其他醇类较低的阈值；另外，香叶醇（FD值=4）呈现花香；α-萜品醇（FD值=4）呈现木香且黑茶后发酵过程中微生物的活性可以决定该物质的产生[20]。

醛类物质中，反式-2-壬烯醛（FD值=64）对康砖茶叶的香气贡献较大，呈现青草香；己醛（FD值=16）、苯乙醛（FD值=16）和壬醛（FD值=4）均对康砖茶叶贡献青草香[20]，这表明感官评价中青草香是由该类物质贡献的。

酮类物质中，反式-β-紫罗兰酮（FD值=64）呈现花香和反式-α-紫罗兰酮（FD值=16）呈现木香和陈旧味，两者均是康砖茶叶主要的香气贡献成分。此外，FD值=4的香气成分为顺式-香叶基丙酮主要呈现花香和木香以及4-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-3-丁烯-2-酮主要呈现甜香，这两种香气化合物在青砖茶叶中均检测到，且前者是青砖茶叶的关键香气成分[25]。

芳樟醇氧化物中，芳樟醇氧化物I（FD值=16）和芳樟醇氧化物II（FD值=4）均呈现花香，大量研究表明芳樟醇氧化物是普洱茶中贡献花香味的关键香气成分，且该类物质的产生也取决于后发酵过程中微生物的活性[10]。

1,2,3-三甲氧基苯（FD值=4）和1,2,4-三甲氧基苯（FD值=4）均呈现陈旧味，是康砖茶叶中主要贡献陈旧味的化合物。此外，有文献报道这两种化合物是普洱熟茶中贡献陈旧味的主要香气化合物，而且普洱茶中甲氧基苯类物质贡献的陈旧气味强度高于茯砖茶[10]；二氢猕猴桃内酯（FD值=4）呈现木香和花香，对康砖茶叶的香气贡献程度中等，该物质也是茯砖茶和普洱茶的重要香气化合物[19]。另外，1,2,3-三甲氧基苯和二氢猕猴桃内酯是康砖茶叶中含量较高的物质，但是其香气贡献程度却不是最大的，原因在于这两种化合物的阈值相对其他化合物较高。

图 3 康砖茶叶5 种关键香气的FD值Fig. 3 Flavor dilution factors of five key aromas in Kangzhuan tea

由图3可知，康砖茶叶提取物FD值较高的特征香气为花香和青草香，其次是木香和陈旧味以及甜香，然而该结果与康砖茶叶提取物感官评价的香气轮廓不一致，原因是GC-O分析的是康砖茶叶提取物中每种挥发性香气成分的香气强度，而感官评价描述的是康砖茶叶提取物整体的香气轮廓。相关研究表明，茶叶的整体香气不仅与其单种成分的香气强弱有关，而且还与各挥发性化合物之间的协同效应有关[29-31]，由于尚未对茶叶各成分协同效应进行研究，目前尚不明确哪些成分的协同对康砖茶叶的香气具有明显影响。

3 结 论

康砖茶叶主要香气轮廓为花香和木香。GC-MS分析该茶叶共鉴定出3 5 种挥发性成分，包括8 种醇类（20.59%）、6 种醛类（9.96%）、8 种酮类（11.95%）、3 种萜烯类（3.49%）、4 种氧化物类（5.17%）和6 种其他类（48.83%），其含量较高的化合物为1,2,3-三甲氧基苯、二氢猕猴桃内酯、2-乙基己醇、雪松醇和苯乙醛。GC-O分析FD值为64的香气化合物为反式-2-壬烯醛（青草香）和反式-β-紫罗兰酮（花香）以及FD值为16的香气化合物为芳樟醇（花香）、己醛（青草香）、苯乙醛（青草香）、反式-α-紫罗兰酮（木香和陈旧味）和芳樟醇氧化物I（花香），这7 种化合物为康砖茶叶提取物的主要香气贡献成分。以上结果揭示了康砖茶叶的风味特征及主要香气成分，为深入认识康砖茶叶香气特征提供了数据参考。未来还需要对各挥发性成分协同作用进行深入研究。