犬细小病毒实时荧光RPA检测方法的建立

熊 炜，薛俊欣，王楷宬，蒋 静，黄保续，田桢干，林颖峥，李 健

（1.上海市检验检疫科学技术研究院，上海200135；2.中国动物卫生与流行病学中心，青岛266032）

犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的犬的一种急性传染病，临床上以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征[1-2]。CPV主要通过直接或间接接触感染，多发于3～6月幼龄犬，感染率可高达100%，致死率为10%～50%[3]。该病的流行无明显季节性，感染犬是本病的主要传染源，犬群一旦发病，极难彻底清除，除犬外，猫、狼、狐、浣熊也可自然感染[4-7]。CPV随粪便、尿液、呕吐物及唾液排出体外，康复犬粪便中可长期带毒[8-9]。已有的诊断方法中，病毒分离、血凝抑制、电镜检查、ELISA等方法操作步骤繁琐，检测周期长，不利于实现快速诊断；胶体金检测方法尽管可以实现快速检测，但是确诊往往需要通过更为灵敏和准确的分子生物学方法；分子生物学方法中，PCR和实时荧光PCR需要特定的扩增仪器，不便于实现现场检疫；尽管环等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术能够实现现场快速检测，但是由于其特异性方面的缺陷容易导致误诊[10-14]。最近的研究表明，重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种新型的、可以替代PCR的核酸检测技术，它能够在20 min内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合野外及检疫现场使用。为了提高口岸对进出境野生及家养犬猫科动物CPV感染情况监测和流行病学调查的效率，本研究建立了CPV实时荧光RPA检测方法，并对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DNA抽提试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kits）购自QIAGEN公司，Taq酶、dNTP、DL2000 DNA marker、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂购自TaKaRa公司；RPA检测试剂购自TwistDx Inc公司；磷酸盐缓冲液（pH7.4）购自Gibico公司；其他试剂购自国药集团上海化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 病毒样品来源及处理 CPV、阳性核酸和组织病料来自于上海口岸的入境宠物及上海地区宠物医院的病犬，组织病料包括病犬的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织器官及血液、尿、粪便等体液样本。本研究使用的犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）、犬冠状病毒（Canine coronavirus，CCV）、犬传染性肝炎病毒（Infectious canine hepatitis virus，ICHV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus，CPIV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、牛细小病毒（Bovine parvovirus，BPV）、小鼠细小病毒（Minute virus of mice，MVM）等由本实验室保存。将待检组织样品加等体积磷酸盐缓冲液研磨匀浆，3000×g离心15 min后，收集上清液待检。

1.3 核酸提取及cDNA模板制备 对于DNA病毒样品，取100 μL组织上清液或体液样本，按DNA抽提试剂盒说明书要求进行病毒DNA提取，最后将DNA用50 μL水溶解，即得PCR模板；对于RNA病毒样品，取100 μL上清液或体液，用TRIzol方法提取RNA，再进行逆转录，得cDNA模板。

1.4 PCR检测 针对CPV的衣壳蛋白（VP2）基因设计引物[15]，扩增基因片段大小为441 bp，其上游引物（CPVF）序列为：5'-ATCACAGCAAACTCAAGC AGAC-3'，下游引物（CPVR）序列为：5'-TGGA GTTGGTATGGTTGGTTTC-3'。反应体系：DNA模板1 μL、10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水补足总体积至25 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸3 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 实时荧光RPA引物和探针 使用Vector NTI Suite软件分析不同国家和地区分离的CPV的VP2基因保守序列，用Primer Express软件设计RPA引物和探针。实时荧光RPA检测的上游引物（RPAY-CPVF）为：5'-ACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAG AGA-3'，下游引物（RPAY-CPVR）为：5'-AGCA ATACATTATCATCTGTTACAGGAAGG-3'，RPA探针（RPAY-CPVP）为：TACATATAT AGCACATCAAGATACAGGAAGA（FAM-dt）（THF）（BHQ1-dt）CAGAAGGAGA-C3。引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。

1.6 实时荧光RPA检测 反应体系为：2×反应缓冲液25 μL、dNTP 7.2 μL、10×探针酶混合物5 μL、上下游引物（RPAY-CPVF、RPAY-CPVR）各2.1 μL、10 μmol/L荧光探针0.6 μL，混匀后，再加入20×核心反应液2.5 μL、50×RT反应液1 μL、50×Exo反应液1 μL；混匀后，加入280 mmol/L醋酸镁2.5 μL、待检核酸溶液1 μL。39℃孵育25 min。反应结束后，查看荧光扩增曲线并进行结果判定。

2 结果

2.1 实时荧光RPA检测CPV的特异性试验 分析CPV的VP2基因序列，设计引物及探针，建立实时荧光RPA检测CPV方法，并利用本方法分别检测其他犬病毒（CDV、CCV、ICHV、CPIV）和其他种属的细小病毒（PPV、BPV、MVM），同时与普通PCR方法进行对比，检测所建立方法的特异性。结果显示：实时荧光RPA检测时，CPV阳性样品在反应5 min后荧光信号出现显著增强，其他犬病毒和其他种属的细小病毒均未检测到荧光信号（图1A）；普通PCR检测时，CPV阳性样品出现特异性扩增，其他对照病毒均呈阴性结果（图1B）。

图1 实时荧光RPA(A)和PCR(B)检测CPV的特异性Fig.1 The specificity analysis of real-time fluorescence RPA(A)and PCR(B) in CPV detection

2.2 实时荧光RPA检测CPV的敏感性试验 为检测建立的实时荧光RPA方法的敏感性，将CPV阳性样品DNA进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL的模板，再分别用实时荧光RPA和PCR方法检测。结果显示，该研究建立的实时荧光RPA与PCR检测样品CPV阳性DNA模板的下限量为1～10 pg（图2）

图2 实时荧光RPA(A)和PCR(B)检测CPV的敏感性Fig.2 The sensitivity of real-time fluorescence RPA(A) and PCR(B) in CPV detection

2.3 实时荧光RPA检测CPV的重复性试验 为了检测建立的实时荧光RPA方法的重复性，将实时荧光RPA方法用于病死犬的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等不同的组织器官及血液、尿、粪便等样本的CPV检测，另有36份CPV阴性犬粪便样品同样进行检测，并且所有样品同时用PCR方法复检。结果显示，经实时荧光RPA检测CPV阳性犬的4份组织样品和血液、尿液、粪便均呈显著荧光信号扩增，而空白对照和所有CPV阴性样品均未检测到荧光信号（图3A），PCR复检结果与实时荧光RPA检测结果一致，符合率为100%（图3B）。

图3 实时荧光RPA（A）和PCR（B）检测CPV阳性犬的不同组织及液体样品Fig.3 Detection of different tissues and liquid samples of CPV positive dogs with real-time fluorescence RPA (A) and PCR(B)

2.4 实时荧光RPA检测CPV分离株 用建立的实时荧光RPA方法检测本实验室不同时期分离的7株CPV野毒株。结果显示，7株CPV经实时荧光RPA检测均出现了荧光信号的显著扩增，而空白对照未检测到荧光信号（图4A）；这7株CPV经PCR检测均扩增出了目的大小的基因片段（图4B）。

3 讨论

利用实时荧光RPA技术可以实现对CPV准确灵敏的诊断。CPV属于细小病毒科细小病毒属，其基因组为单链DNA，该病毒属中还包括人细小病毒B19、PPV、BPV、MVM以及猫细小病毒等[16-17]。本研究建立的检测CPV实时荧光RPA方法具有良好的特异性，与CPV同步检测的其他犬病毒（如：CDV、CCV、ICHV、CPIV）以及其他动物的细小病毒（如：PPV、BPV、MVM）均未出现RPA荧光信号的增强。通过与国标中提供的PCR检测方法的比对，证实本研究建立的检测CPV实时荧光RPA方法具有与PCR方法一致的特异性和敏感性。通过对不同CPV阳性组织、体液样本和36份CPV阴性样品以及CPV分离株的检测和验证，证实本研究建立的实时荧光RPA方法具有与标准PCR方法一致的稳定性和可靠性。

图4 实时荧光RPA（A）和PCR（B）检测7种CPV野毒株Fig.4 Detection of 7 CPV wild strains by real-time fluorescence RPA (A)and PCR(B)

实时荧光RPA检测方法具有众多优势，与传统PCR方法相比，其检测周期极短（包括结果判读在内，仅需10～20 min）、操作简单（只需将核酸与检测体系混合放于恒温设备中即可，RNA检测不需逆转录过程）、检测设备便携（笔记本大小，充电一次可运行12 h）、结果判定简便直观，特别适合于现场及野外使用[18]。

由于犬细小病毒病是一种高度接触性烈性传染病，其发病快、致死率高，因此做好CPV的预防免疫，早诊断、早隔离是控制CPV传播的主要途径[19-20]。本研究建立的实时荧光RPA方法丰富了现有的CPV核酸检测和诊断体系，其独特的优点特别适合在野外监测点、犬科动物繁育场和一线兽医检测实验室推广使用，这对提高检疫效率、控制CPV传播、保护犬科动物健康和减少养殖业经济损失具有重要的意义。