山东牛轮状病毒的分离鉴定及其卵黄抗体应用试验

秦晓冰 ， 周建梅 ， 张洪亮 ， 单 虎

(青岛农业大学 山东省预防兽医学重点实验室 ， 山东 青岛 266109)

牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是以引起犊牛精神沉郁、食欲减退和水样腹泻为主要特征的一种严重危害养牛业的传染病，常伴有继发感染而引起犊牛死亡[1-2]。BRV普遍存在于污染的饲料、器具、饮水及患病牛的排泄物中，消化道为主要的传播途径，多发于30日龄内的犊牛，成年牛往往呈隐性感染而持续排毒。犊牛感染BRV尚无特效疗法，通常采取隔离和对症治疗，常因犊牛心衰和代谢性酸中毒而导致死亡，死亡率高达50%以上[3]。

BRV为双链RNA病毒，包含6种结构蛋白VP1～VP4、VP6、VP7和6种非结构蛋白NSP1～NSP6，根据VP4和VP7外壳蛋白基因型的差别BRV可以分为G型和P型，目前已经发现有12个G型和11个P型[4]。VP4、VP6、VP7这3种结构蛋白有良好的免疫原性，成为疫苗的研究热点，但不同基因型之间的交叉保护性差，使得BRV疫苗研究非常困难[5-6]。卵黄抗体作为一种特异性免疫球蛋白，已经在家禽和家畜的多种病毒病的防治中取得了显著的效果，但有关BRV的紧急预防与治疗的报道还非常鲜见[7]。

本试验利用山东省犊牛腹泻病料分离鉴定了BRV，制作了油乳剂灭活苗，并用该灭活苗多次免疫蛋鸡，利用纯化的卵黄抗体对犊牛进行了攻毒保护试验，旨在为犊牛BRV提供安全良好的保护，为有效预防和治疗犊牛BRV提供了一种新思路。

1 材料与方法

1.1 样本与细胞系 2018年7月在山东省莱西市某牧场采集犊牛腹泻样品6份，BRV参考毒株、MA-104(恒河猴胎肾传代细胞系)和兔抗牛源牛轮状病毒VP6重组蛋白的阳性血清，由山东省预防兽医学重点实验室提供。

1.2 主要试剂与仪器 DMEM培养基、胎牛血清，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；琼脂糖、50×TAE、核酸提取试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司；DL-2 000 DNA Marker、HiScriptII One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)，均购自Vazyme公司；0.25% DETA-胰酶，购自Gibco公司。Biofuge primor高速台式离心机(德国Heraeus公司)；台式高速冷冻离心机(H-2050-R1型，湖南长沙湘怡检测设备有限公司)；超低温冰箱(MDF382E型，SANYO公司)；PCR扩增仪(Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600)；电子天平(德国Sartorius BS-210S)；琼脂糖水平电泳槽(DYCD-31D，北京六一仪器有限公司)；电泳仪(Powerpac basic型，BIO-RAD)；光凝胶成像系统(AT126D型，台湾)。

1.3 病毒分离培养 用pH 7.0的PBS把病料稀释成0.2 g/mL的悬液，振荡2 min，5 000 r/min离心10 min，取上清。上清液除菌后加入终浓度为20 μg/mL 的胰酶，37 ℃激活30 min，接种1 mL于铺满单层MA104细胞的细胞培养瓶，37 ℃培养1 h，每瓶加入7 mL终浓度1 μg/mL胰酶细胞维持液，5%的CO2培养箱37 ℃培养，逐天观察，培养96 h后收毒。按上述方法继续传8代后，细胞出现稳定病变80%以上时收毒，-20 ℃冻存备用。

1.4 病毒纯化与毒价测定 将BRV病毒液加入到蜀牛瓶，加入NaCl和聚乙二醇PEG 6 000， 使其终浓度分别为2.5%和10%，4 ℃搅拌过夜，离心收集沉淀，加入缓冲液和氯仿后，离心收集上清液，4 ℃保存备用。

将激活的病毒液混合物用DMEM营养液10倍梯度稀释，从10-1到10-8稀释液依次吸取100 μL接种到长满单层MA104细胞的96孔细胞板上，设6个重复与正常细胞对照。37 ℃、5%的 CO2恒温培养箱中孵育1 h，加入100 μL的无血清终浓度1 μg/mL胰酶细胞维持液。连续观察5 d，计录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的半数组织培养感染剂量TCID50。

1.5 病毒鉴定。

1.5.1 RT-PCR 鉴定 根据GenBank登录的轮状病毒标准株NCDV和代表株IND株的高保守区VP6基因，设计上游引物：5′-GTCGAAGGCACATTATACTCC-3′；下游引物：5′-GATTGTGGTGCAATTCCATTT-3′。引物由上海派森诺生物科技有限公司合成，目的片段长度为284 bp。按TaKaRa 核酸提取试剂盒说明书进行病毒RNA提取，以RNA样品为反转录模板，依照HiScriptII One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)说明书进行VP6基因的RT-PCR扩增。反应体系(50 μL)：基因组RNA 2 μL，引物(20 μmol/L) 各2 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，2×One Step Mix 25 μL，RNase free ddH2O 16.5 μL。反应程序：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定后回收。

1.5.2 病毒的电镜观察 将20 μL的病毒液滴在铜网上，静置20 min，吸去多余毒液，加5 μL的磷钨酸染色液染色4 min，用滤纸吸干，置透射电镜下观察。

1.6 BRV卵黄抗体的制备与效价检测 BRV病毒液中加入甲醛调终浓度为0.2%，混匀，37 ℃灭活48 h，将灭活液用1.3方法盲传3代，检查细胞有无病变。将灭活液与弗氏不完全佐剂按1∶2混合并充分乳化，2 mL/只三点肌内注射140日龄鸡，免疫后21 d和42 d各加强免疫1次，同时设立注射生理盐水对照组。收集首免后7～70 d的鸡蛋，采用水稀释硫酸铵盐析法提纯卵黄抗体，采用琼脂扩散法(AGP)测定收集的卵黄抗体IgY效价[8-9]。

1.7 BRV卵黄抗体保护试验 将血清和粪便BRV抗体均为阴性的初生牛犊分为试验组(A)和对照组(B)，每组5头。试验组犊牛出生后6 h，饲喂卵黄抗体膏1次(20 g/头)，24 h后重复饲喂，3日龄始每日上、下午各喂食1次卵黄抗体粉(10 g/头)，饲喂至18日龄，对照组不使用抗体。犊牛4日龄检测粪便BRV为阴性后隔离饲养，2组全部经口接种BRV，剂量为2 mL/头(TCID50=10-5.62/mL)。4～7日龄，上下午各饲喂代用乳2L/头，8日龄后上下午各加喂250 g犊牛颗粒料，自由饮水。分别于犊牛1、4、5、8、11、14日龄和18日龄采用RT-PCR检测粪便BRV；用ELASA试剂盒检测犊牛血清IgG，并用酶标仪读取吸光值(OD值)，计算抗体对BRV的抑制率，抑制率/%=[(阴性对照OD值-样本OD值)/阴性对照OD值]×100%。

2 结果

2.1 病毒的分离、纯化及毒价测定 病料接种MA104细胞后，盲传至第4代开始出现细胞病变(CPU)，第8代CPU稳定。在接毒48 h后出现细胞固缩、变圆，72 h后细胞多数死亡，细胞液变黄，出现明显CPU，阴性对照细胞无病变，见中插彩版图1。经蚀斑纯化，病毒滴度为10-5.62TCID50/mL。

2.2 病毒鉴定

2.2.1 RT-PCR鉴定 纯化的病毒培养物经过RT-PCR扩增出284 bp的特异性条带，见图2，与预期目标条带一致。经BLAST比对，与GenBank中BRV的VP6基因序列相似性为99%，从分子水平证实该分离毒株为BRV，命名为SD-LX株。

图2 分离BRV毒株的RT-PCR鉴定Fig.2 Isolated BRV RT-PCR identification1：阴性对照； 2：阳性对照； 3：分离毒株培养物； M：DL-2 000 DNA marker1：Negative control; 2：Positive control; 3：Isolated BRV cultures; M：DL-2 000 DNA marker

2.2.2 SD-LX株电镜观察 将SD-LX株培养物电镜下观察，可见直径60～70 nm的病毒粒子，呈典型的车轮状形态(图3)。

图3 SD-LX株培养物透射电镜观察Fig.3 SD-LX viral cultures observed through transmission electron microscope

2.3 SD-LX株卵黄抗体的制备与效价 灭活的SD-LX株病毒液接种于MA104细胞和盲传3代未有CPU，对照组细胞出现典型CPU。BRV油苗注射产蛋母鸡免疫后，卵黄抗体消长规律见图4。由图4可知，油苗首免后2～3周IgY效价约在1.8 log2，二免后达到4.8 log2，三免后第2周可测得IgY抗体效价达到峰值6 log2，之后处于约5.5 log2。

图4 免疫SD-LX株油苗后卵黄抗体制剂抗体效价消长规律Fig.4 IgY titers after immunized oil vaccine of SD-LX strain

2.4 卵黄抗体对犊牛保护试验 攻毒后12～24 h，对照组犊牛均出现体温升高，试验组有2头正常，3头升高。试验期内对照组犊牛体重降低，并出现不同程度的腹泻；试验组体重2头升高，3头降低，降低的犊牛出现轻微腹泻。犊牛粪便BRV检测见表1。由表1可知，卵黄抗体对A2、A3起到了良好的保护作用，治愈率为40%。

表1 攻毒前后犊牛粪便BRV检测Table 1 BRV in calf stools tested before or after challenges

根据ELISA抗体检测试剂盒对分离的犊牛血清进行BRV的IgG检查结果与酶标仪读取的OD值(阴性对照：2.742 4；阳性对照：0.069 9)，计算阳性抑制率，结果见中插彩版图5。由图5可知，A2与A3抗体水平较其他个体高，A1、A4、A5的抗体水平低于A2、A3，但总体高于对照组。经Duncan氏法分析，18日龄犊牛A1、A2、A3、A4抗体水平极显著高于对照组(P<0.01)，A5显著高于对照组(P<0.05)，说明卵黄抗体有效率为100%，但因犊牛的个体差异治疗效果不同。

3 讨论

倪亚炜1985年在北京地区检测了29份牛粪便，BRV的阳性率为55.2%[10]。李鑫等[11]在2005—2006年间对我国山东省、山西省、北京市、内蒙古等12个省市自治区的不同年龄、不同品种的1 760份 牛血清进行了BRV感染调查，发现总体阳性率达到了99%。张坤等[12]2014—2015年在新疆部分地区奶牛场，采集犊牛腹泻粪便91份，BRV阳性率为23.08%～90.91%。王牧川等[13]2015年对重庆市的8个肉牛场81份腹泻粪便样品进行BRV检测，阳性率为66.7%。表明BRV在我国分布广，危害性持久，是引起犊牛腹泻的主要原因之一，制约了养牛业的持续发展。

本试验采用MA104细胞分离BRV，优选浓度为20 μg/mL的胰蛋白酶处理病毒接种物以及无血清的终浓度为1 μg/mL胰蛋白酶的维持液，与魏锁成等[14]探讨的BRV细胞培养方法和葛雨[15]分离BRV的胰蛋白酶浓度均有所不同。表明BRV的分离培养与分离株的特性、病料新鲜度及阳性病料中病毒的含量等有着密切的关系。本试验检测BRV的PCR靶基因是编码VP6蛋白的基因节段，该片段是A群RV的特异性抗原，在BRV不同血清型之间具有高度的保守性，是检测BRV的首选靶基因[16]。这与周芳等[5]和陆亚东等[17]采用RT-PCR鉴定BRV的方法是一致的。

1973年美国农业部批准BRV的G6型减毒疫苗，是目前世界上唯一商品化的BRV疫苗，我国BRV疫苗防控尚处于研发阶段。常继涛等[18]依据我国地区BRV流行株G6和G10，制作减毒疫苗免疫产前奶牛，犊牛通过哺乳获得母源抗体从而获得保护，为疫苗的研制奠定了基础。卵黄抗体(IgY)是禽类血清中的免疫球蛋白(IgG)转移到卵黄中形成的特异性多克隆抗体，因质优价廉、性质稳定等优点，近年来广泛应用于动物疫病防控领域[19]。本试验采用水稀释法，结合盐析与透析来提纯BRV的IgY，对出生4日龄的犊牛进行了攻毒后口服保护试验，有效率与对照组相比达到了100%，治愈率为40%。这与Vega等[20]研究报道的口服BRV的IgY对犊牛可提供80%的保护，且能减少BRV导致犊牛死亡率研究结果相符。本试验人工感染犊牛BRV，犊牛口服卵黄抗体获得了有效的保护，表明IgY可以用于犊牛BRV的预防与治疗。