构树青贮发酵菌株筛选及鉴定

许 涛 魏中锋 樊祜卿 孟菊梅

（①山东省单县农业农村局 274300②山东省菏泽市动物疫病预防控制中心 ③山东省菏泽市动物卫生技术中心）

构树是一种优质的天然植物蛋白饲料，有研究证明构树叶中粗蛋白含量高达18%～24%，近年来生物技术的发展，构树有望被开发成一种新型蛋白质饲料[1-3]。通过筛选构树发酵菌株，提高发酵过程中蛋白酶、纤维素酶、单宁酶含量，降解其中的抗营养因子和粗纤维，提高构树营养利用价值。

1 材料和方法

1.1 菌株分离筛选的培养基及仪器

1.1.1 培养基 纤维素酶筛选培养基、蛋白酶筛选培养基、单宁酶筛选培养基按照《常见细菌系统鉴定手册》[4]中的配方配制。

1.1.2 仪器 JC-ST-06脂肪测定仪(上海精密仪器仪表有限公司)、SLQ-6型粗纤维测定仪(上海纤检仪器有限公司)、BOXUN洁净工作台(北京市西城区半导体设备一厂)、SM-5显微镜(日本尼康)、DSX-280KB24立式压力蒸汽灭菌器(上海申安)、DWS-250型生化培养箱(江苏达沃斯机械科技有限公司)、XDS-100C三目倒置显微镜(奥林巴斯)、SX2-12-10箱式电阻炉(上海纤检仪器有限公司)。

1.2 筛选方法

1.2.1 样品采集 从构树根际土壤、青贮池、腐败构树茎叶土壤、其他腐败树叶土壤等自然环境采集样品作为分离源进行细菌富集培养。

1.2.2 菌种筛选 将采集的样品用无菌水清洗后进行梯度稀释，制成10-1～10-5的不同浓度，选取10-1、10-3、10-53个浓度的样品，分别均匀涂布在蛋白酶产生菌筛选培养基、纤维素酶产生菌筛选培养基、单宁浓度耐受培养基上，37℃下培养48h，挑选单菌落，斜面4℃保藏菌种。

1.2.3 菌种的纯化 对分离菌株进行单菌落划线培养48h，选取透明圈较大的单个菌落，再进行划线培养，重复4～5次，以此提高菌落纯度。

1.2.4 菌种的复筛 选将筛选的菌种和酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌接种到营养肉汤中，制备种子液，准备复筛选。将培养的种子液菌种按照0.5%的量均匀加入到粉碎好的构树茎叶中，在培养箱中37℃，发酵5d。将发酵好的构树用烘箱105℃烘干15min，再用60℃继续烘烤，直至构树烘干。然后用仪器测定处理好样品中粗纤维含量、粗蛋白含量、单宁酶活力来判断其发酵效果，进行菌种筛选。

1.2.5 粗纤维、粗蛋白测定 粗纤维测定(GB64 34-94)、粗蛋白的测定(凯氏定氮法GB6432-94)、单宁酶活力测定：以没食子酸丙酯作为单宁酶的底物，根据没食子酸丙酯吸光值的变化，计算出单宁酶的活力。酶活力的定义：40℃反应条件下，100μl酶液每分钟使没食子酸丙酯溶液在270nm处减少0.01个吸光度值定义为1个酶活力单位。酶活力计算公式：酶活力(U/ml)=[OD270nm(测定管)-OD270nm(对照管)]×稀释倍数/0.01。

1.3 筛选菌种的鉴定

1.3.1 菌株培养pH值的确定 将筛选的菌株接种到不同pH值的营养琼脂培养基上，37℃恒温培养24h，观察菌株的生长情况。

1.3.2 菌株培养生长温度的确定 将筛选的菌株接种到营养琼脂培养基上，分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下恒温培养24h。

1.3.3 菌株厌氧性测定 将筛选的菌株穿刺接种于厌氧培养基中，37℃恒温培养7d，观察记录生长情况，如果只在表面生长者即为好氧菌，若沿穿刺线生长者则为兼性厌氧菌，若沿穿刺线下部生长者为厌氧菌。

1.3.4 菌种基因鉴定 对筛选菌株用核酸提取试剂盒进行DNA的提取；选用细菌16Sr DNA通用引物进行PCR扩增[11,12]；电泳检测PCR产物，用纯化试剂盒进行对PCR产物进行纯化提取；用pGEM-T载体试剂盒进行连接；然后对连接产物进行感受态细胞转化培养；对鉴定的阳性克隆重组质粒送基因测序公司测序。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离

比较筛选培养基筛选出来的菌种其菌落大小以及水解圈大小，最终获得两株较优的蛋白酶产生菌，命名为D1、D2；两株纤维素酶产生菌命名为X1、X2；两株单宁酶产生菌为N1、N2。

2.2 菌种的复筛选

表1 菌种复筛选的结果 (%)

表2 单宁酶诱导培养基不同单宁浓度对2株细菌酶活力的影响 (U/ml)

从表1得出D1、D2发酵效果最好，其蛋白含量高达24.11±0.21、24.85±0.11，X1、X2的粗纤维含量最低，对粗纤维降解能力最强，采用SPSS软件对表中数据进行方差分析，表 1构树叶组与其它组存在显著差异(P＜0.05)，这说明通过发酵的构树叶粗蛋白含量组明显高于于未发酵的构树叶组，粗纤维含量明显低于未发酵组。

由表2可知，N1菌株在1%组的单宁酶活力最大，均显著高于0.5%与1.5%组(P＜0.05)，0.5%组与1.5%组相比差异显著(P＜0.05)；N2菌株在1%组的单宁酶活力最大，通过0.5%组与1.5%组相比差异显著(P＜0.05)，0.5%组与1.5%组相比差异不显著(P＞0.05)。以上分析表明，单宁酶诱导培养基1%的单宁浓度对于N1、N2菌株单宁酶的产生具有很好的诱导作用，而0.5%和1.5%浓度组诱导作用略差，原因可能是浓度太小对菌株的刺激作用太小，而浓度太大就会对菌株繁殖及单宁酶的产生起到消极作用。

2.3 菌种鉴定

2.3.1 菌株生长 pH值的确定观察结果显示D1、D2、X1、X2菌pH值6.0～8.0的平板上生长良好，N1、N2在pH值5.0～7.0的平板上生长较好。

2.3.2 菌株生长温度的确定 经培养后观察到各筛选菌种均能在25～50℃的环境下生长，但是在25℃、50℃两个温度培养时明显比较其他温度生长明显缓慢。在30～45℃的培养环境下，菌种均能显著生长，但在40℃以上培养时，会出现菌种老化的速度逐渐加快，所以筛选菌株的最适的生长温度为30～35℃左右。

2.3.3 对氧气的需求 经过营养琼脂培养基穿刺培养，发现各筛选菌株在穿刺管中各处均有生长，由此证明这6种菌株都属兼性厌氧菌。

2.3.4 16Sr DNA基因组序列测序结果 将测序所得序列和GenBank的序列进行Blast序列同源性比对，D1该菌属于肠杆菌目，肠杆菌科，普罗威登斯菌属，属于产碱普罗威登斯菌；D2菌株属于伯克氏菌目，属于克斯特菌；X1、X2鉴定结果显示其亲缘关系与芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌、藓样芽孢杆菌、未定种名的菌株最为接近，为芽孢杆菌属成员。N1、N2均属于假单胞菌菌科，经进一步分析得知属于铜绿假单胞菌。

3 结论

构树是一种营养丰富的木本饲料，含有较高的粗蛋白、粗灰分、粗脂肪、磷，粗纤维含量适宜[5,6]，可以缓解我国蛋白质饲料匮乏、缓解蛋白质饲料对外依存的压力。但构树中单宁、木质素等抗营养因子含量较高[7-9]，对畜禽养殖来说饲料适口性较差，会影响畜禽采食量。本试验通过培养基筛选出产蛋白酶菌、产纤维素酶菌、和产单宁酶菌，可明显提高构树中蛋白质含量，降低纤维素含量和单宁含量，为构树饲料进一步开发提供依据。