雌激素受体β基因rs1256064和rs1256049位点单核苷酸多态性与子宫内膜异位症的关系研究

郝娜，田芸婕，贾亚静，路晓琳

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)多发于育龄期妇女，由多因素、多遗传基因作用导致具有活性的子宫内膜组织异位，生长在子宫腔以外并反复周期性出血，从而引起患者慢性盆腔痛、痛经、不孕等[1-2]。近年来，随着社会快速发展，生活节奏加快，临床上EMs发病率呈逐年升高的趋势，成为临床上常见且危害较大的一类妇科疾病，严重影响妇女的生活质量、生育功能和身心健康[3]。目前EMs的发病机制尚未得到明确阐明，临床上也缺乏治疗EMs的特效药，因此探究与EMs发生发展相关基因，以期找寻预防、诊断和治疗EMs的新靶点对EMs患者意义重大。雌激素受体β(estrogen receptorβ，ERβ)作为可溶性糖蛋白分子在转录水平上调节基因表达，雌激素在机体内发挥生理功能必须通过ERβ介导[4-5]。EMs受雌激素调控，因此ERβ基因的变化可能影响雌激素的生理作用，从而导致EMs发病[6]。ERβ基因在EMs患者血清中表达水平未见相关研究，因此本研究使用聚合酶链反应—限制性内切酶片段长度多态性方法检测EMs患者血清中ERβ基因rs1256064和rs1256049位点单核苷酸多态性，分析rs1256064和rs1256049位点等位基因频率与EMs患者临床病理特征的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取于2017年6月—2019年6月邯郸市中心医院、河北医科大学第四医院妇科收治的60例EMs患者作为研究对象(EMs组)，依据2015年“子宫内膜异位症的诊治指南”[7]，超声影像为无回声区内有密集光，腹腔镜检观察病变形态，经病理检查确诊。EMs组年龄21 ～51(35.23±3.48)岁，体质量指数(22.94±3.19)kg/m2；根据美国生育协会在1997年修订的EMs分期(R-AFS)[8]，Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期19例，Ⅳ期21例；病理类型，卵巢型21例，腹膜型20例，混合型19例；痛经情况，无或轻度痛经29例，中或重度痛经31例；产次，0次11例，1次34例，≥2次15例；有流产史33例；有不孕史19例。另选取同期来邯郸市中心医院体检的健康女性67例作为对照组，年龄22～52(36.17±2.91)岁，体质量指数(22.74±4.50)kg/m2；产次，0次13例，1次36例，≥2次18例；有流产史36例；有不孕史20例。2组受试者年龄、体质量指数、孕产情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》，入选者知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：(1)月经周期正常；(2)6个月内未曾使用激素类药物。排除标准：(1)患有其他妇科肿瘤或妇科病的者；(2)伴有心、肾、肝功能不全者；(3)免疫功能缺陷者；(4)处于妊娠期的受试者。

1.3 主要试剂和仪器 rs1256064和rs1256049引物序列由上海生物工程公司合成；DNA提取试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；SimpliAmp PCR仪购自美国赛飞世尔科技有限公司。

1.4 检测方法 清晨取所有受试者空腹静脉血6 ml，用肝素抗凝，随后置于-20℃冰箱中待用。

1.4.1 用DNA提取试剂盒提取基因: rs1256064位点上游引物序列5’-TGATTGCTCAGCACATAGCC-3’，下游引物序列5’-GACAGGTCTTCAGCACCACA-3’；rs1256049位点上游引物序列5’-TCTACACACACAGGGAGCTGA-3’，下游引物序列5’-CAGGACTTTGTTCCCACTCAC -3’；PCR扩增体系共20.0 μl，其中上下游引物(5μmol)各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl，SYBR Mix 10.0 μl，cDNA(25 ng/ml) 2.0 μl。PCR反应条件：95℃ 5min，(95℃变性45s，60℃延伸60s)×40，72℃ 10min。

1.4.2 酶切PCR扩增引物: rs1256064和rs1256049位点的PCR产物经RsaⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切体系共20.0 μl，其中PCR扩增产物16 μl，10×Buffer 2.1 μl，RsaI 0.7 μl，BSA 0.2 μl。酶切反应条件为37℃ 4 h。将酶切后的产物经凝胶电泳分析，凝胶成像仪成像，随后根据酶切产物片段的大小确定基因型。

2 结 果

2.1 2组rs1256064位点基因型和等位基因频率比较 经PCR扩增出rs1256064位点基因318 bp片段，经RsaⅠ限制性内切酶酶切后产生153 bp和165 bp 2个片段，在群体中组成pp、Pp和PP 3种不同类型的基因型。与对照组相比，EMs组患者rs1256064等位基因pp基因型数显著升高，PP基因型数显著降低(P<0.01)，p等位基因频率显著升高，P等位基因频率显著降低(P<0.01),见表1。

2.2 2组rs1256049位点基因型和等位基因频率比较 经PCR扩增出rs1256049位点基因299 bp片段，经RsaⅠ限制性内切酶酶切后产生105 bp和172 bp 2个片段，在群体中组成pp、Pp和PP 3种不同类型的基因型。与对照组相比，EMs患者组rs1256049等位基因PP基因型数显著升高，Pp基因型数显著降低(P<0.05)，P等位基因频率显著升高，p等位基因频率显著降低(P<0.05), 见表2。

2.3 rs1256064、rs1256049位点基因与子宫内膜异位症临床病理特征的关系 rs1256064和rs1256049位点等位基因频率与EMs患者临床分期、有无流产、有无不孕史有关(P<0.05)，与EMs患者年龄、病理类型、有无痛经、产次无关(P>0.05)， 见表3。

2.4 影响子宫内膜异位症发病的多因素Logistic回归分析 多因素Logistic回归分析表明，临床分期、不孕史、rs1256064位点p等位基因频率升高、rs1256049位点P等位基因频率升高是EMs发病的危险因素(P<0.05)，见表4。

表1 2组rs1256064位点基因型和等位基因频率比较

表2 2组rs1256049位点基因型和等位基因频率比较

表3 rs1256064和rs1256049位点与子宫内膜异位症临床病理特征的关系 [例(%)]

表4 影响EMs发病的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

EMs因侵袭性强、复发率高成为临床上妇科难治疾病，育龄期妇女发病率高达10%，成为妇女不孕症的危险因素[9-10]。有研究发现，不孕症妇女患者中25%～50%伴有EMs，盆腔体检正常的育龄女性超过50%患有不同程度的EMs。到目前为止，很多学者对EMs的发病机制开展大量的临床研究和基础实验，但仍无法完全阐述EMs的具体发病机制[11-12]。学术界对免疫学、子宫内膜种植、遗传学发病机制颇有争论，随着生物学研究的不断发展，ERβ基因与EMs发生发展的关系受到重视，成为研究的热点[13]。但大多从细胞或动物模型上探讨ERβ与EMs的关系，在临床上未曾对ERβ基因具体核苷酸位点进行研究。因此本研究选ERβ基因rs1256064和rs1256049位点单核苷酸，试图从基因水平上找寻ERβ基因rs1256064和rs1256049位点单核苷酸多态性与EMs发病之间的相关性。

ERβ基因由40 kb碱基组成，位于14q23-24.1，包含8个外显子和7个内含子，广泛分布在两性组织和生殖器官中，在人乳腺、卵巢、子宫内膜中表达，且分泌期低表达，增生期高表达[14-15]。研究发现，ERβ可能与子宫内膜癌、子宫内膜异位症相关[16]。李鹏程等[17]研究发现，ERβ在EMs大鼠模型子宫内膜中高表达，可上调血管内皮生长因子(VEGF)、氨基末端激酶(c-Jun)表达水平，在EMs发展中发挥重要作用。在广西壮族绝经妇女血清雌二醇、孕酮水平研究中，ERβ基因经Rsa-Ⅰ内切酶酶切出RR、Rr、rr、r、R基因组，r基因组孕酮和雌二醇水平显著降低，黄体生成素、促卵泡激素显著升高[18]。本研究发现，经PCR扩增出rs1256064位点基因318 bp片段，经RsaⅠ限制性内切酶酶切后分别产生153 bp、165 bp 2个片段，与对照组相比，EMs组患者rs1256064等位基因pp基因型数和p等位基因频率显著升高，PP基因型数和P等位基因频率显著降低，提示rs1256064位点基因与EMs相关。对rs1256049等位基因研究发现，经PCR扩增出rs1256049位点基因299 bp片段，经RsaⅠ限制性内切酶酶切后产生105 bp和172 bp 2个片段，与对照组相比，EMs组患者rs1256049等位基因PP基因型数和P等位基因频率显著升高，Pp基因型数和p等位基因频率显著降低，提示rs1256049位点基因与EMs有关，可能此类基因特征患者更易患EMs。临床病理特征分析发现，rs1256064和rs1256049位点等位基因频率与EMs患者临床分期、有无流产、有无不孕史有关，与EMs患者年龄、病理类型、有无痛经、产次无关，提示rs1256064和rs1256049位点等位基因频率可能参与EMs进程，与EMs发生发展相关，多因素Logistic回归分析表明，临床分期、不孕史、rs1256064位点p等位基因频率升高、rs1256049位点P等位基因频率升高是EMs发病的危险因素，提示该类患者具有患EMs风险，应定期体检，注意防治。

综上所述，EMs患者rs1256064位点基因pp基因数和p等位基因频率、rs1256049位点基因PP基因数和P等位基因频率显著升高，与患者临床分期、不孕史有关，是EMs患病的危险因素，提示rs1256064和rs1256049位点可能作为早期预防和判断EMs的临床指标。但rs1256064和rs1256049位点基因具体作用机制还有待从动物和细胞模型进行深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

郝娜：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；田芸婕：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；贾亚静：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；路晓琳：进行统计学分析