黄柏苍术汤对急性痛风性关节炎鼠模型抗炎作用的研究

杨 虹 罗 干 熊梓汀 李巧玲 陈雄斌 王 勇

痛风是由于体内嘌呤代谢紊乱，尿酸排泄减少，体内持续高尿酸状态，引起过饱和的尿酸析出沉积于组织或器官的一种非特异炎性反应[1]。常累及关节，致反复发作性的关节炎；肾脏引发慢性肾间质性肾炎和尿路结石等。急性痛风性关节炎临床上常表现为突发的关节红、肿、热、痛及功能障碍，好发部位多见于第一跖趾关节、踝关节、膝关节[2]。对于该病的治疗中西医采取的方式有所不同，西医一线用药主要为秋水仙碱、非甾体消炎药、激素等，能够起到迅速控制症状的作用，但是同时也存在着一定的弊端，如不良反应大，有些患者药物依赖性差等[3，4]。中医药治疗痛风在我国已有悠久的历史，而黄柏苍术汤在中医药治疗痛风中有一定的临床疗效，但其作用机制目前尚不明确[5，6]。本研究通过观察不同浓度黄柏苍术汤对急性痛风性关节炎模型大鼠的治疗后关节肿胀值的动态变化及治疗后关节液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的变化，初步探讨黄柏苍术汤治疗急性痛风性关节炎的可能机制。

材料与方法

1.药物与试剂：黄柏仓术汤的主要组成成分：黄柏10g、苍术10g、制天南星10g、桂枝10g、威灵仙15g、防己15g、桃仁10g、红花10g、龙胆草10g、茯苓15g、萆薢12g[6]。水煎浓缩待用。临用前用0.8% CMC-Na稀释。秋水仙碱悬液是由云南昆明制药集团生产的秋水仙碱片研磨呈粉末状后溶于蒸馏水形成浓度为0.01mg/ml的混悬液。尿酸购自美国Sigma公司。TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6 ELISA检测试剂盒均购自深圳欣博盛有限公司。

2.实验动物：SPF级雄性SD大鼠48只，体质量为200～240g，均为3月龄。所有动物均由四川省医学科学院实验动物研究所提供。饲养温度21～27℃，湿度50%±5%，昼夜光照及通风环境自然调节。实验程序严格按照动物管理章程。

3.主要仪器：酶标仪(美国Bio-Rad公司)，FA2004B型电子天平(上海越平科学仪器有限公司)，移液枪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，低温冰箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

4.尿酸钠悬液的制备：称取80mg尿酸盐晶体，加入无菌PBS溶液中，制成终浓度为80mg/ml的尿酸盐混悬液。以上操作均在无菌操作台中进行。

5.实验动物的造模与给药：48只大鼠在开放的实验环境下饲养1周后，随机分为模型组、黄柏苍术高剂量组、黄柏苍术中剂量组、黄柏苍术低剂量组、秋水仙碱组、正常组，每组各8只大鼠。对各组大鼠进行吸入乙醚麻醉后，在无菌条件下以右踝关节外侧后方为穿刺点，除正常组注射PBS外，其余各组均注入50μl 80mg/ml的尿酸盐混悬液，局部消毒预防感染。尿酸盐注射后分别灌喂相应的药物，其中黄柏苍术高剂量组、黄柏苍术中剂量组、黄柏苍术低剂量组分别为12、6、3g/kg，秋水仙碱组为0.1mg/kg。正常组、模型组灌喂0.9%氯化钠溶液。每次灌胃2.5ml，每天1次，连续3天。

6.关节肿胀值：分别用游标卡尺在6、12、24、48、72h测量6组大鼠注射部位同一部位的直径。用该部位的直径代表其关节肿胀值。

7.关节液炎性因子的测定：给药3天后对大鼠进行颈脱臼处死，收集注射部位关节腔积液。根据各ELSIA试剂盒说明书的方法检测TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的表达。

8.统计学方法：采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料的比较用χ2检验；多样本均数的比较及均数的两两比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.柏苍术汤对急性痛风性关节炎关节肿胀值影响的比较：关节腔注射尿酸盐悬液后，除正常组外，其余5组小鼠均在1h内出现关节肿胀值增加的情况，且伴随有红、肿、热，大鼠活动功能受限现象，说明急性痛风性关节炎动物模型造模成功。模型组、黄柏苍术高剂量组、黄柏苍术中剂量组、黄柏苍术低剂量组、秋水仙碱组大鼠的关节肿胀值在6、12、24、48h均高于正常组(P<0.05)；在注射后72h正常组的关节肿胀值与秋水仙碱组、黄柏苍术汤中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而模型组、黄柏苍术高剂量组、黄柏苍术低剂量组与正常组间比较均大于正常组(P<0.05)，同时黄柏苍术高剂量组和黄柏苍术低剂量组关节肿胀值显著小于模型组(P<0.05，表1)。

2.黄柏苍术汤对急性痛风性关节炎关节液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6表达的影响：模型组大鼠关节液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6均显著高于其余5组(P均<0.05)。其中，黄柏苍术中剂量组、秋水仙碱组的TNF-α、IL-1β表达水平显著低于黄柏苍术高剂量组和黄柏低剂量组(P均<0.05)，与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。IL-8、IL-6的表达水平在黄柏苍术高剂量组、黄柏苍术中剂量组、黄柏苍术低剂量组、秋水仙碱组、正常组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

表1 5组大鼠不同时间点关节肿胀值比较

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与秋水仙碱组比较，ΔP<0.05；与黄柏苍术汤高剂量组比较，▲P<0.05；与黄柏苍术汤中剂量组比较，&P<0.05

表2 5组大鼠关节液中炎性因子的表达水平

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与秋水仙碱组比较，ΔP<0.05；与黄柏苍术汤高剂量组比较，▲P<0.05；与黄柏苍术汤中剂量组比较，&P<0.05

讨 论

急性痛风关节炎是一种由尿酸盐晶体沉积于组织和器官引起的急性非特异性炎性反应[7]。本研究造模通过在关节腔局部注射尿酸混悬液，人工模拟痛风的急性发作过程，该模型的构造可有效的研究和评价急性痛风性关节炎药物治疗效果，这主要依据既往的痛风动物模型而选择[8]。尿酸盐悬液注射到局部关节后首先迅速引起大量单核-吞噬细胞聚集，大量聚集的巨噬细胞逐渐对尿酸盐进行吞噬[9，10]。同时，单核-吞噬细胞还可以通过合成和分泌炎性细胞因子如IL-1、TNF-α、趋化因子来进一步方法炎性反应和组织损伤。活化模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)从而激活体内的固有免疫。体内的MSU还可以通过激活Toll样受体及髓样分化因子88，从而启动下游的核因子(NF)-κB，进一步促使TNF-α、IL-1β的表达，促进炎症的级联损伤[11，12]。研究发现，尿酸盐可通过激活NALP3炎性体进一步加剧痛风的炎性反应[13～15]。因此机体通过分泌IL-1β诱导急性炎性反应，固有免疫激活后会募集大量的炎性细胞如单核细胞、粒细胞等，通过大量产生趋化因子及TNF-α、IL-8、IL-6等炎性因子进一步加剧痛风急性发作部位的炎性反应和组织损伤[16]。

本研究显示，在注射后模型组的大鼠关节肿胀值随着时间的进展呈逐渐减低的趋势，这与痛风自然缓解的过程一致。模型组关节肿胀值显著高于黄柏苍术高剂量组、黄柏苍术中剂量组、黄柏苍术汤低剂量组、秋水仙碱组，且在72h黄柏苍术高剂量组、黄柏苍术汤低剂量组关节肿胀值低于秋水仙碱组、黄柏苍术汤中剂量组，该结果说明了黄柏苍术汤治疗有效，且存在一定剂量的关系，因为随着黄柏苍术的剂量改变大鼠的关节肿胀组变化并非完全一致，从研究结果显示中剂量的结果较优，可能是药物浓度过高或过低在炎性反应某阶段会参与炎性因子的产生。

本研究还发现，模型组大鼠关节液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6显著增高，均高于其余5组，该组的目的主要是起到阳性对照，可见本研究造模成功，组间有可比性。其中，黄柏苍术中剂量组、秋水仙碱组的TNF-α、IL-1β表达水平显著低于黄柏苍术高剂量组和黄柏低剂量组，可能是由于黄柏苍术汤治疗痛风急性关节炎有某一最适剂量，可能秋水仙碱、中剂量汤剂对TNF-α、IL-1β抑制作用更强。IL-8、IL-6的表达水平在黄柏苍术高剂量组、黄柏苍术中剂量组、黄柏苍术低剂量组、秋水仙碱组、正常组间比较差异无统计学意义，可能是由于IL-8、IL-6受到4组试剂的抑制作用相同。具体药物剂量对不同细胞因子的抑制作用尚不明确，可能与炎性因子在炎症诱发缓解的触发环节不同有关，还需进一步实验研究加以证实[17]。

本研究对大鼠进行不同药物灌胃暂未发现不良反应，考虑可能是由于研究样本量较少，也可能是由于未对研究对象进行生化方面的相关检测，无法确定有无肝脏、肾脏损伤，但是在实验过程中各组大鼠活力正常。后期可通过加大样本量观察有无药物不良反应。

综上所述，黄柏苍术汤可能通过抑制炎性细胞分泌炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6等，缓解急性炎性反应，改善急性痛风性关节炎的关节症状。其效果是否与黄柏苍术汤的剂量有关还需要进一步验证。