TLC法快速辨别与真伪鉴定川黄柏和关黄柏

梁凤兰,赵海洲,练益成,黄政贵

（1.肇庆学院生命科学学院，广东肇庆526061；2.肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆526061；3.广东省湛江市食品药品检验所，广东湛江524022）

TLC法快速辨别与真伪鉴定川黄柏和关黄柏

梁凤兰1,赵海洲1,练益成2,黄政贵3

（1.肇庆学院生命科学学院，广东肇庆526061；2.肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆526061；3.广东省湛江市食品药品检验所，广东湛江524022）

为了建立中药材川黄柏(Phellodendri Chinense)和关黄柏(Cortex Phellodendri Amurensis)的快速辨别和真伪鉴定方法，基于川黄柏含极少量黄柏酮而关黄柏含大量黄柏酮，同时川黄柏和关黄柏两者均含有盐酸小檗碱，用薄层色谱法中的分级展开法，在日光灯下将样品与黄柏酮标准品对照，通过两者显著差异性快速辨别川黄柏和关黄柏，同时在紫外灯下与盐酸小檗碱标准品对照实现真伪鉴定.该方法操作简单，具有快速，分离效果和重现性好的优点.薄层色谱法能够应用于川黄柏与关黄柏的快速辨别和真伪鉴定，有助于该类中药材的质量控制.

川黄柏；关黄柏；薄层色谱法；差异性辨别；真伪鉴定

黄柏为芸香科植物黄皮树的干燥树皮，习称“川黄柏”.关黄柏为芸香科植物黄檗的干燥树皮[1].川黄柏和关黄柏是临床常用中药，味苦性寒，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮等作用[2].川黄柏与关黄柏的成份有较大的区别，脂肪酸的组成有比较大的差异[3].《中国药典》将川黄柏与关黄柏分列为两种药材，但没有记载川黄柏与关黄柏的快速辨别和真伪鉴定方法[3]，只有少数文献报道了有关川黄柏或关黄柏的鉴别研究[4-11].基于薄层色谱法对市场上流通的川黄柏、关黄柏中药材进行快速辨别和真伪鉴定，目前还未有报道.

薄层色谱法是根据同种吸附剂对各种成分的吸附能力不同，使移动相(溶剂)流过固定相（吸附剂）的过程中，连续不断地重复吸附和解吸附，以完成各种成分互相分离，定性分析物质成分的实验技术，在医学、药学、生化、卫生、环境、食品、化工等领域被广泛应用.薄层色谱法的展开方法分为多级展开、分级展开和双向展开，本研究采用分级展开方法，以同块硅胶板沿同方向，依次使用2种展开剂进行展开，从而达到对吸附性质或分配性质存在着明显区别的组分进行分离[12-16].

由于川黄柏含极少量黄柏酮而关黄柏含大量黄柏酮，且川黄柏和关黄柏均含有盐酸小檗碱，而伪品不含盐酸小檗碱，用薄层色谱法中的分级展开法，在第一级展开时在紫外灯下与盐酸小檗碱对照品对照实现真伪鉴定.在第二级展开后喷以质量分数10%硫酸乙醇溶液显色剂显色，并与黄柏酮对照品对照，通过差异性来快速辨别川黄柏和关黄柏.为建立快速鉴定药材真伪，辨别川黄柏与关黄柏的技术标准提供依据，有利于该类中药材的质量控制.

1 仪器与药品

1.1 仪器

WFH-201B紫外透射反射仪（上海精科实业有限公司）；定量毛细管（1 μL和2 μL）.

1.2 样品

川黄柏（四川），川黄柏（四川，批号：D1409030），川黄柏（四川,批号：150701），川黄柏（四川，带皮），川黄柏（广西），关黄柏（吉林），关黄柏（内蒙古），关黄柏（正品）.桐树皮染色川黄柏伪品，杨树皮染色川黄柏伪品.

1.3 对照品

川黄柏对照药材（批号：12150-201105），关黄柏对照药材（批号：120937-200506），黄柏酮对照品（批号：111923-201303），盐酸小檗碱对照品（批号：200210）.

1.4 试剂和药品

硅胶G板和H板（青岛海洋化工集团公司），其他试剂均为分析纯.

2 方法与结果

2.1 薄层板制备

将硅胶G板和H板置于105°C烘箱内进行30 min活化.

2.2 样品溶液的配制

分别取1.2中的样品各0.2 g置于100 mL锥形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯，超声处理30 min，过滤，水浴浓缩至1 mL，即得样品溶液，备用.

2.3 对照品的配制

取0.2 g的川黄柏与关黄柏对照药材分别置于2个100 mL锥形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯，超声处理30 min，过滤，水浴浓缩至1 mL，即得对照药材溶液，备用.

取黄柏酮对照品适量，加入甲醇配制成1 mL含1 mg黄柏酮的对照品溶液，备用.

取盐酸小檗碱对照品适量，加入甲醇配制成1 mL含1 mg盐酸小檗碱的对照品溶液，备用.

2.4 薄层鉴别方法的建立

2.4.1 展开剂的选择

取活化后的商品硅胶G板，点样(点样量均为2 μL)，在展开剂中分别展开（图1）.

由图1所示，展开剂b和e的分离效果较好，清晰且无拖尾，Rf值约为0.6.因此选用氯仿-甲醇（体积比7:1）展开剂为一级展开剂，石油醚（60-90）-乙酸乙酯（体积比4:3）展开剂为二级展开剂.

图1 不同展开剂展开效果对比

2.4.2 显色方法的选择

试验对于川黄柏与关黄柏的分辨以及真伪鉴别，基于是否含有盐酸小檗碱和黄柏酮含量，因此，如何选择这两种物质的显色方法十分重要.盐酸小檗碱可以用活化后的硅胶G板点样，选用氯仿-甲醇（体积比7:1）为一次展开剂展开晾干后，通过观察365 nm波长处紫外光斑点来判定结果.黄柏酮的显色方法有：用活化后的硅胶G板点样，选用氯仿-甲醇（体积比7:1）为一级展开剂展开晾干后，再以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（体积比4:3）为二级展开剂展开后晾干，喷以质量分数10%硫酸乙醇显色剂在110°C下加热至斑点清晰（图2a），或者喷以质量分数5%香草酫溶液，置于110°C下加热，直至斑点清晰（图2b）.

图2 显色剂显色效果对比

由图2可见，a中色谱斑点清晰，显色方法较好，b中色谱斑点非常模糊，难以分辨，所以选用a显色方法.2.4.3 点样量的选择

取黄柏酮对照品和盐酸小檗碱对照品于2块薄层板上从左至右依次点样，分别是0.5 μL、1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL、3.5 μL和4 μL，并以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（体积比4:3）和氯仿-甲醇（体积比7:1）展开剂对上述对照品展开，结果如图3所示.

图3 点样量对比

由图3所示，黄柏酮从第四个点开始斑点均显示清晰，盐酸小檗碱从第二个点开始斑点均显示清晰，因此选择2 μL为黄柏酮对照品点样量，1 μL为盐酸小檗碱对照品点样量.

2.4.4 温度的影响

分别取黄柏酮和盐酸小檗碱对照品，点样量为2 μL和1 μL；取川黄柏对照药材、关黄柏对照药材和川黄柏、关黄柏样品，点样量为2 μL，点于活化后的薄层板上，分别在 6 °C（图4 a和b）、30 °C（图4 c和d）中同时展开，取出晾干，在365 nm紫外光下观察荧光，然后喷质量分数10%硫酸乙醇显色剂显色，在日光下观察.

图4 不同温度下效果对比

如图4所示，在一定的相对湿度（60%）下，a-d的Rf值均约为0.55，表明在6～30°C温度范围内对鉴别无明显的影响.

2.4.5 湿度的影响

在活化后的薄层板上点样黄柏酮对照品2 μL，关黄柏样品2 μL，盐酸小檗碱对照品1 μL，然后在不同相对湿度（20%、50%和80%）的层析缸中分别展开，显色，检视（表1和图5）.

表1 不同相对湿度条件

图5 不同相对湿度下对比

结果显示，相同温度（28 °C）下，相对湿度为20%（a、d）、50%（b、e）和80%（c、f）时，对应的Rf值分别为0.72、0.64和0.55，可见相对湿度会影响展开效果：相对湿度越高，对应的Rf值就越小；相对湿度越低，色谱斑点变得模糊且分散.因此，在进行实验时控制相对湿度为45%～60%.

2.4.6 溶剂的影响

由于黄柏酮与盐酸小檗碱均溶于甲醇和乙酸乙酯，因此分别使用甲醇和乙酸乙酯配制对照品溶液与释稀样品溶液，进而比较其对展开效果的影响，由图6所示，2种溶剂对实验结果均无明显影响.

图6 乙酸乙酯、甲醇对实验结果的影响

2.4.7 展开剂的预饱和时间对实验结果的影响

分别取黄柏酮对照品，川黄柏样品各2 μL，盐酸小檗碱对照品1 μL点于活化后的薄层板，比较不同预饱和时间（5 min和30 min）对实验结果的影响，由图7可知两者的Rf值均为0.4，而b、d的斑点更为清晰，分离效果更好，因此预饱和时间选择30 min为佳.

图7 预饱和时间对比

2.5 样品检测

取不同的10种样品溶液在常温（25°C）和相对湿度（61%）的条件下，与川黄柏、关黄柏对照药材、黄柏酮对照品，在预制硅胶G板上点样，一次展开剂为氯仿-甲醇（体积比7:1），二次展开剂为石油醚（60-90）-乙酸乙酯（体积比4:3），展开后喷以质量分数10%硫酸乙醇显色剂显色.结果如图8所示，图8a和b中3～5和11与c和d中3的样品中均含有黄柏酮，表明川黄柏（广西）是关黄柏；而2个伪品（图a和b中的12，图8c和d中的7）均不含盐酸小檗碱与黄柏酮，此结果与高效液相色谱分析结果一致，表明该方法适合于关黄柏、川黄柏的快速鉴别.

图8 基于TLC法的样品检测结果

3 结果与讨论

目前川黄柏和关黄柏的鉴别是通过对川黄柏与关黄柏的来源、药材性状、显微鉴别等方面进行辨别[3]，但它们性状极为相似，还需要用到显微鉴别，步骤较为复杂且对鉴别人员的要求较高；同时，在川黄柏药材薄层色谱特征鉴别研究[9]中，虽然做出了对川黄柏和关黄柏的快速鉴别，但无真伪鉴别判断，且其中的显色方法重复性较差.研究采用薄层色谱法中二级展开方法，在同一薄层硅胶G板上，以第一次展开剂为氯仿-甲醇（体积比7:1），在365 nm波片下与盐酸小檗碱对照品色谱图比较鉴别川黄柏真伪，以第二次展开剂为石油醚（60-90）-乙酸乙酯（体积比4:3），展开后喷以质量分数10%硫酸乙醇显色剂显色，与黄柏酮对照品色谱图比较进行川黄柏与关黄柏辨别.该方法不但可以鉴别川黄柏及关黄柏的真伪，还能进一步辨别川黄柏与关黄柏，且对人员设备要求低，具有前处理简便快捷、成本低、准确度高、重现性好等优势，为川黄柏及关黄柏的质量控制及市场监管提供了有效手段.

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京:中国医药科技出版社,2015:146-147,305-306.

[2] 张冠英,董瑞娟,廉莲.川黄柏、关黄柏的化学成分及药理活性研究进展[J].沈阳药科大学学报,2012,29(10):812-821.

[3] 薛娟,张宏伟,孙宜春,等.川黄柏与关黄柏中脂肪酸成分的组成及差异[J].贵州农业科学,2015,43(8):220-222.

[4] 宋兵双,谢昭明.HPLC法对黄柏不同期采收药材不同部位的小粟碱含量比较研究[J].湖南中医药导报,2000,6(l):38.

[5] 黄位猛.黄柏和关黄柏的鉴别[J].科教导刊,2014(7):191-202.

[6] 贡济宇,赵跃刚,张皎月,等.不同产区关黄柏的质量分析[J].中医药学报,2003,31(4):26-27.

[7] 朱志明,赖潇潇,苏慕霞.不同产地黄柏及关黄柏有效成分的含量测定[J].临床医学工程,2011,18(1):106-108.

[8] 方清茂,曹浩,舒光明.川黄柏中盐酸小檗碱的含量及其道地性研究[J].华西药学杂志,2004,19(4):275-276.

[9] 祝晨蔯,林朝展.黄柏药材薄层色谱特征鉴别研究[J].广东药学,2004,14(1):8-9.

[10] 孙毓庆,王延琮,林乐明,等.薄层扫描法及其在药物分析中的应用[M].北京:人民卫生出版社,1990:27-30.

[11] 曾镇广.薄层色谱中展开剂的选择[J].新课程学习,2010(7):18.

[12] 何志昂,王权.浅谈TLC中展开剂的选择[J].中国高新技术企业,2009(7):44-45.

[13] 周同惠.纸色谱和薄层色谱[M].北京:科学出版社,1989:17.

[14] 陈岩.中华人民共和国药典中药薄层色谱彩色图谱集[M].广州:广东科技出版社，1993:2-6.

[15] 刘琬晖,严铭铭,赵大庆.硅胶薄层层析展开剂构成的变化对不同极性成分Rf值的影响[J].长春中医药大学学报,2007,23(3):20-21.

[16] Szaboles N,Dallenbach-Tolke K,Sticher O.The‘PRISMA’optimization system in planar chromatography[J].J.Planar.Chromatogr.,1988,1(4):336-342.

Rapid Distinguishment and Identification of Cortex Phellodendri Chinenseand Cortex PhellodendriAmurensis Based on TLC

LIANG FengLan1,ZHAO HaiZhou1,LIAN Yicheng2,HUANG ZhengGui3
(1.School of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China;2.School of Food and Pharmaceutical Engineering,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China;3.Zhanjiang Institute for Food and Drug Control,Zhanjiang,Guangdong 524022,China)

The method of grading expansion in TLC is used to establish a method for rapid distinguishment and identification ofCortex Phellodendri ChinenseandCortex Phellodendri amurensisascortex phellodendri amurensiscontains plenty of obacunone butcortex phellodendri chinensecontains a little,and bothcortex phellodendri chinenseandcortex phellodendri amurensiscontain berberine hydrochloride.Cortex phellodendri chinenseandcortex phellodendri amurensisare rapidly distinguished based on the significant differences comparing the two samples withobacunonestandard under the light.The identification of authenticity is achieved by comparing the samples withberberinehydrochloride standard under the UV lamp.This method is easy,effective and good at reproducibility of thin layer chromatography.TLC method can be used in the rapid distinguishment and identification ofcortex phellodendri chinenseand cortex phellodendri amurensis,benefiting the supervision and inspection of these Chinese medicinal materials.

Cortex Phellodendron;Cortex Phellodendron Amurensis;TLC;differential distinguishment;identification

R927

A

1009-8445（2017）05-0044-08

2017-02-26

梁凤兰（1982-），女，肇庆学院生命科学学院实验师.

黄政贵（1982-），男，广东省湛江市食品药品检验所.

（责任编辑：姜学霞，张宝杰）