TLR9敲除可减轻阿霉素诱导的心肌损伤

唐 楠 刘方圆 郭 振 马淑青 樊 迪 杨 振 唐其柱

以阿霉素(doxorubicin，DOX)为代表的蒽环类药物被广泛用于乳腺癌、白血病等多种恶性肿瘤的临床治疗，然而，心脏毒性是阿霉素严重的、致命的不良反应，也因此限制了该类药物在肿瘤治疗中的应用。阿霉素的心脏毒性不良反应包括心律失常、心肌病、心肌梗死、左心室功能障碍和心力衰竭[1, 2]。阿霉素引起充血性心力衰竭(CHF)的发生率与总剂量有关[3, 4]。一项大规模回顾性分析观察到阿霉素累积剂量达400mg/m2，心力衰竭的发生率为5%，累积剂量达550mg/m2和700mg/m2时，心力衰竭发生率分别为26%、48%，在累积剂量超过400mg/m2后，年龄较大的患者(>65岁)CHF发生率更高[5]。Cardinale等[6]组织的前瞻性研究发现蒽环类药物治疗后的心脏毒性大多发生在第1年之内，心脏毒性的发生与蒽环类药物剂量和治疗结束时的LVEF有关。近年来大量实验研究发现阿霉素所致心肌损伤表现为氧化应激的增加和拓扑异构酶的抑制，从而导致细胞内活性氧产生增加、细胞DNA的损伤、细胞内钙失调、线粒体功能障碍、能量代谢失衡，最终导致心肌细胞凋亡、细胞外基质重塑[7, 8]。尽管大量的实验研究揭示了阿霉素所致的心脏损伤的机制，但许多抗氧化剂似乎没有太大的心脏保护作用，传统的心血管病药物(如β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂)的保护作用也非常有限[9]。目前尚缺乏对阿霉素所致心脏损伤的监测、预防和治疗手段[10]。因此，寻找阿霉素作用的新靶点仍然是一项挑战。

Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)是在序列和功能上高度保守的蛋白质分子系列，在炎症、免疫、肿瘤中发挥着重要作用。Toll样受体9(TLR9)作为一种细胞内的重要模式识别受体，主要在树突细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等免疫细胞中表达，包括心肌在内的几个器官的非免疫细胞中也发现了TLR9的表达[11, 12]。TLR9参与机体固有免疫、发挥抗病毒作用；还可以通过激活 NF-κB以及MAPKs，诱发免疫炎性反应，并参与细胞自噬过程[13]。研究发现，TLR9相关的信号通路在众多的心血管疾病的病理生理发展机制中具有重要作用，参与心肌细胞的炎性反应，诱导线粒体功能障碍和死亡，进而导致心肌收缩功能障碍[14, 15]。因此本研究推测TLR9可能参与阿霉素所致的心肌损伤的发生、发展过程，并且目前尚缺乏TLR9在阿霉素诱导的心肌损伤中的作用的实验研究，本研究拟通过体内外实验探究TLR9对阿霉素性心肌损伤的影响及机制。

材料与方法

1.主要材料:C57B/6J、TLR9-KO小鼠购自北京华富康生物科技有限公司；H9C2细胞购自上海中国科学院细胞库；ODN2088购买于德国Miltenyi公司；盐酸阿霉素(DOX)购自北京索莱宝科技有限公司;TUNEL试剂盒购自瑞士Roche 公司；GAPDH、Bax、Bcl-2、C-caspase-3抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司。

2.实验分组及模型建立:在体实验分为WT组、TLR9-KO组、WT+DOX组、TLR9-KO+DOX组；选取8周龄健康雄性C57B/6J、TLR9-KO小鼠(22～26g)，随机分为4组，WT组、TLR9-KO组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液10ml/kg，分别于0、7、14、21天皮下注射,为对照组；WT+DOX组、TLR9-KO+DOX组小鼠腹腔注射阿霉素10mg/kg，分别于0、7、14、21天皮下注射，为模型组。离体实验分为PBS组、PBS+ODN2088组、DOX组、DOX+ODN2088组；大鼠来源H9C2细胞培养于10%胎牛血清的DMEM培养基，在 37℃、5%CO2条件下培养，细胞浓度达80%时传代培养并制备细胞爬片，PBS组为对照组，DOX组加入1μmol/L DOX构建细胞DOX模型，PBS+ODN2088组、DOX+ODN2088组加入0.2μmol/L ODN2088。

3.检测心肌损伤标志物:造模第3天取小鼠眶静脉血，离心取上清，检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。

4.检测心功能及血流动力学指标:造模第28天检测小鼠心功能，备皮，充分暴露小鼠胸前区，1.5%异氟烷麻醉，使用高频超声探测仪测量并记录左心室厚度、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(IVESD)、舒张末期室间隔厚度(IVSd)和左心室短轴缩短率(FS%)。应用PowerLab数据采集分析系统描记压力-容积曲线，测量血流动力学指标，等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(dp/tmax)以及等容舒张期左心室压力下降的最大速率(dp/dtmin)。随后解剖小鼠心脏，称重，并计算心重/胫骨长。将分子生物学检测用的心脏组织置于液氮，并储存在-80℃，供后续实验用；将病理学染色用的心脏组织置于10%KCl溶液中，使心脏停搏于舒张期。

5.病理学染色:将取出的心脏组织用甲醛固定，石蜡包埋后制备组织石蜡切片，进行TUNEL染色，TUNEL染色完毕后于免疫荧光镜下拍照，以供分析心肌细胞凋亡指数。

6.Western blot法检测心肌细胞Bax、Bcl-2、C-caspase-3的含量：提取实验小鼠心脏组织蛋白，进行BCA 定量，制备上样蛋白，进行10% SDS-PAGE电泳，分离蛋白后转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，分别与抗Bax、Bcl-2、C-caspase-3、gapdh抗体于 4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶5000) 室温孵育1h，TBST 洗膜3次，ECL化学发光后成像系统进行图像采集。

结 果

1.TLR9对阿霉素诱导的急性心肌损伤的影响:在DOX皮下注射后的第3天，检测血清中的心肌损伤标志物，结果显示给予DOX刺激后，小鼠的心肌酶明显高于相应的对照组(P<0.05)，CK-MB和LDH的值几乎是对照组的2倍，然而，与野生型小鼠比较，TLR9敲除小鼠在DOX刺激后的心肌损伤程度明显降低(P<0.05)，详见图1。

图1 TLR9对阿霉素所致小鼠心肌损伤的影响A.CK-MB;B.LDH。*P<0.05

2.TLR9对阿霉素诱导的慢性心肌损伤的影响：给予DOX刺激后的28天，与对照组比较，DOX刺激后的小鼠的短轴缩短率减低(P<0.05)，而敲除TLR9后，心功能得到了改善，短轴缩短率明显增加(P<0.05)，dP/dtmax、dP/dtmin也高于WT+DOX组，但差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。另外，通过HE染色观察心肌细胞横截面积，DOX刺激可减小心肌细胞横截面积(P<0.05)，TLR9敲除减轻了这一效应，DOX刺激后，TLR9敲除组小鼠心肌细胞横截面积大于野生型(P<0.05)，详见图2。

表1 各组小鼠心功能指标

与WT组比较，*P<0.05；与WT+DOX组比较，#P<0.05

3.TLR9减轻阿霉素诱导的心肌损伤的机制：通过Western blot法实验，笔者发现，与对照组比较，给予DOX刺激小鼠的BAX、C-caspase-3的蛋白表达量明显增高(P<0.05)，Bcl-2的表达量明显降低(P<0.05)， 同样给予DOX刺激，TLR9敲除鼠的BAX、C-caspase-3的表达量的增加并不明显(P<0.05)；相反，Bcl-2的表达量却比野生型小鼠有所增加(P<0.05)，详见图2。笔者又通过TUNEL检测了细胞凋亡的程度，结果显示，与对照组比较，DOX组小鼠的细胞凋亡明显增加(P<0.05)，而TLR9敲除可明显降低DOX所致的心肌细胞凋亡程度(P<0.05)，详见图3。

图2 各组小鼠心肌Bax、Bcl-2、C-caspase-3的表达情况A.蛋白质电泳图;B.分别为Bax、C-caspase-3、Bcl-2的蛋白定量图。*P<0.05

图3 各组小鼠心肌细胞凋亡情况(TUNEL染色,×200)*P<0.05

4.TLR9抑制剂降低阿霉素所致细胞凋亡：DOX刺激后，相比于对照组H9C2细胞的凋亡显著增加(P<0.05)，而在给予TLR9抑制剂ODN2088之后，H9C2细胞凋亡程度比DOX组明显减轻(P<0.05)，详见图4。

图4 各组H9C2的凋亡情况(TUNEL染色,×200)*P<0.05

讨 论

阿霉素作为一种临床上广泛使用的化疗药物，其发挥抗癌作用主要是通过插入细胞DNA，干扰拓扑异构酶Ⅱ-DNA裂解复合物，阻碍 DNA的重新连接和双链切割修复，从而阻断细胞DNA的复制和转录，杀死癌细胞。阿霉素的这种作用直接导致细胞DNA损伤、活性氧的产生以及细胞凋亡[9, 16]。也因此不可避免地带来一系列抗癌不良反应，其中，心脏毒性便是最为突出和致命的一种，也因而限制了其在肿瘤患者中的应用，降低了肿瘤患者的预后。

本研究发现，DOX刺激早期小鼠血清心肌损伤标志物明显升高，表明DOX可导致心肌细胞的急性损伤，而且在DOX诱导心肌损伤的慢性模型中，笔者发现小鼠心功能受到损伤，短轴缩短率明显下降，心肌细胞横截面积相比于对照组也明显缩小，检测的凋亡相关指标也明显升高，而Bcl-2却明显减低，表明DOX导致心肌细胞萎缩，凋亡增加，TUNEL染色也证实了这一点。然而当敲除TLR9后，DOX所致的急性心肌损伤得到缓解，LDH、CK-MB相比于野生型小鼠明显降低，此外，在慢性心肌损伤模型中，敲除TLR9后，小鼠的心功能也明显得到改善，短轴缩短率显著升高，此外TLR9敲除鼠的心肌细胞横截面积也有所增加。相比于野生型小鼠，BAX、C-caspase-3的蛋白表达量在TLR9敲除鼠也明显降低，而保护细胞免于凋亡的Bcl-2蛋白表达较对照组上调，TUNEL染色也支持TLR9减轻DOX所致心肌细胞凋亡这一结论。通过离体细胞实验，笔者发现当抑制了TLR9的作用后，DOX诱导的细胞凋亡也受到抑制。因此，TLR9敲除可能通过抑制细胞凋亡减轻DOX所致心肌损伤。

TLR9作为Toll样受体家族的一员，大量研究证实了其在炎性反应中发挥举足轻重的作用。在压力负荷诱导的小鼠心力衰竭模型中发现，敲除TLR9减轻了心肌组织的炎症和心脏功能障碍[15]。持续的激活TLR9，会增加心肌组织和全身的炎性反应，并且使SERCA2a特异性敲除的舒张期心力衰竭的心脏功能更加恶化[17]。在急性心肌梗死模型中发现mtDNA可以通过激活TLR9，从而激活NF-κB，导致心肌细胞出现线粒体功能障碍和死亡[18]。在动脉粥样硬化小鼠模型，TLR9通过诱导产生多种促炎因子、趋化因子及其受体的迅速表达，进而促进细胞因子的产生，启动炎性反应，促进动脉粥样硬化的发生[19]。

在阿霉素所致心肌损伤中，DNA损伤、氧化应激及炎性反应是关键环节，因此，推测TLR9敲除可能通过减轻炎性反应、降低氧化应激从而抑制细胞凋亡，发挥保护阿霉素所致心肌损伤的作用。有研究发现在阿霉素诱导的急性炎性反应中，免疫细胞的凋亡起着关键作用，而TLR-2/TLR-9-MyD88信号通路在启动对凋亡这种免疫原性形式的炎性反应中起核心作用[20]。此外，TLR9也能被从自噬中逃逸的受损线粒体DNA激活，引发心肌细胞炎性发应，并引发心肌炎和扩张型心肌病[21]。因此推测在阿霉素介导的心脏损伤中也可能发生类似的机制，但仍然需要更完善的实验进一步探究TLR9在阿霉素所致心肌损伤中的作用机制。

综上所述，本研究发现TLR9敲除可以改善DOX小鼠的心功能，通过抑制凋亡减轻阿霉素所致心肌损伤，这可能为临床预防及治疗阿霉素性心肌损伤提供新的方向，但其具体作用机制仍有待于开展深入的实验探讨。