细胞蜡块技术在晚期肺癌恶性胸水中的应用价值*

彭丽姿 周 兵 张 菁

（九江市第一人民医院病理科 江西九江 332000）

肺癌临床症状不典型，部分发现时多为晚期病例，失去了手术机会［1］。肺癌的传统治疗，组织学分型及分期起着决定性的作用。因此，合并有恶性胸水的病例，细胞蜡块技术结合免疫组化的精准诊断就显得尤为重要。随着分子生物学的发展及对肿瘤的发病机制的不断研究，分子靶向治疗改变了肺癌传统治疗［2］。相对传统治疗，其具备特异性高，不良反应低等特点。2016年中国非小细胞肺癌患者EGFR基因突变检测专家共识推荐所有的非小细胞肺癌患者进行EGFR基因突变检测［3］。该实验选取肺癌的恶性胸水细胞学蜡块和对应的组织学标本为研究对象，探讨细胞蜡块在晚期肺癌恶性胸水患者中的诊断及分子检测中的应用价值及临床意义。

1 临床资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年9月-2019年9月九江市第一人民医院收治的30例组织学确诊并伴有恶性胸水的晚期肺癌患者，其中男19例，女11例，年龄35～83岁，中位年龄65岁，吸烟患者12例，不吸烟患者18例。

1.2 仪器及试剂

RM2235切片机及ASP300s组织脱水机为莱卡公司产品，荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品，HZ18液基离心制片机、BX-IX生物组织包埋机为孝感宏业医用仪器有限公司产品；免疫组化试剂：CK7、TTF-1、p40、NapsinA、CD56、CgA、Syn、p63等抗体为中山金桥公司产品，DNA提取试剂盒为凯杰公司产品，人类EGFR基因突变检测试剂盒为武汉友芝友医疗公司产品。

1.3 细胞蜡块及免疫组化

新鲜胸水室温下静置30min，弃上清液后，2000r／min离心10min；弃上清液，取细胞沉渣，加中性福尔马林固定6h左右，用纱布包裹后放入包埋盒，脱水，制成细胞蜡块。

胸水细胞蜡块、组织活检标本按3μm厚度切片，经验丰富技师采用Envision system二步法并按试剂说明严格操作，高年资病理医师按试剂说明的阳性定位进行判读。

1.4 DNA提取

胸水细胞蜡块及对应的组织活检标本常规10μm切片5张，60℃烤箱30min，常规脱蜡，经病理评估后用盖玻片刮取肿瘤组织密集区域转移至1.5mlEP管中，按照试剂盒说明书提取DNA，并用分光光度计检测其浓度及纯度。

1.5 EGFR基因突变的检测

用ARMS法检测EGFR基因18-21号外显子G719X、S768I、T790M、L858R、L861Q、Ins、Del的突变情况。按照试剂盒说明书进行操作：计算实验所需反应数，将PCR反应液移至PCR反应管中，准备样本：DNA浓度稀释至15ng／μL以下，加入1.8μL酶混合液，用8种PCR反应液分别检测每个样本。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，采用χ2检验对细胞蜡块与组织活检标本EGFR突变率差异，p＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞蜡块切片

胸水细胞蜡块经HE切片后，相对与细胞学玻片肿瘤细胞更加集中，玻片更易观察，异型肿瘤细胞结构清晰可见，部分存在明显的腺腔样结构，详见图1。

图1 腺癌胸水细胞蜡块切片HE染色（×100）

2.2 免疫组织表达情况

胸水细胞蜡块中有25例主要表达TTF-1（见图2）、NapsinA和CK7腺癌标记。3例主要表达p40和p63鳞状细胞癌标记。2例表达神经内分泌特异性标记CD56、Syn、CgA小细胞癌标记，同时TTF-1也有部分表达。与之对应的组织学标本比较显示两组表达情况较为一致。

图2 腺癌细胞TTF-1标记，细胞核阳性呈棕黄色（×40倍）

2.3 EGFR基因突变检测

25例腺癌胸水细胞学蜡块中EGFR基因突变率为48%（12／25），包括7例19号外显子缺失突变（见图3）和5例21号外显子点突变L858R（见图4），未检出18号外显子G719X突变、20号外显子T790M、S768I和Ins突变及21号外显子L861Q突变。对应的25例腺癌活检组织学标本突变率为52%（13／25），包括7例19号外显子缺失突变和6例21号外显子点突变L858R，未检出18号外显子G719X突变、20号外显子T790M、S768I和Ins突变及21号外显子L861Q突变，两种肺腺癌标本EGFR突变结果差异无统计学意义（p＞0.05），详见表1。余下3例鳞状细胞癌细胞蜡块和组织学标本均未检出突变。

图3 细胞蜡块19外显子del突变图

图4 细胞蜡块21外显子L858R点突变

表1 腺癌胸水细胞蜡块与组织活检的EGFR突变结果比较

3 讨论

胸腔积液是晚期肺癌患者最常见的并发症之一，脱落细胞学涂片，是检测胸水脱落细胞学的重要方法［4］。但常规的细胞学涂片收集的细胞少，易重叠，易掉片，不能长期保存［5］。而细胞蜡块技术的发展弥补了这些不足，其利用收集新鲜胸水后反复离心聚集、固定后用石蜡包埋，制作成细胞学蜡块，不仅具备可反复切片，保存方便等特点，还可以作为免疫组化和后续的分子学诊断材料，大大的提升了诊断的灵敏度和准确性［6］。随着分子生物学的发展及对肿瘤发病机制的研究，以分子靶向为主导的个体化治疗具有特异性高，不良反应低等特点，彻底改变了肺癌的治疗策略，正成为目前研究的热点［7］。针对肿瘤细胞中EGFR突变的特异性分子治疗非小细胞肺癌的靶向药物已被研究并广泛应用于临床［8］。EGFR能通过调节酪氨酸激酶（TK）下游信号通路，促进肿瘤细胞的增殖。2004年首次研究报道酪氨酸激酶-ASE抑制剂（TKIs）治疗NSCLC的疗效与EGFR基因18-21号外显子的突变状态密切相关［9］。此后多项研究表明，对于敏感性EGFR突变的肺腺癌患者，应用TKIs治疗在反应率（ORR）、无进展生存期（PFS）和生活质量上均优于传统化疗［10］。该研究制作脱落细胞蜡块后免疫组织化学标记结果显示腺癌作为恶性胸水最常见的肿瘤来源，占恶性胸腔积液的绝大部分，这和既往的研究结果类似，TTF-1和NapsinA被证实为标记肺II型肺泡上皮最可靠的标记，两者联合应用被认为是转移性肺腺癌的确诊依据［11］。肺鳞癌为胸部常见的肿瘤，但一般为中央型且较少产生积液，联合鳞状上皮特有的标记物P40和CK5／6可以确诊。小细胞神经内分泌癌目前也不少见，具有恶性程度高，侵袭能力强的特点，特异性表达CD56、Syn、CgA等神经内分泌抗体。该实验中，所有的病理诊断类型和细胞蜡块表型与对应的组织学诊断无差异。在EGFR基因检测对比研究发现，腺癌细胞蜡块标本和组织活检标本均检出了19号外显子缺失突变和21号外显子L858R突变这两种最常见的突变类型，这与既往的多量研究一致，相对于欧美人15%的突变率，亚裔肺腺癌的EGFR突变率较高，约40%的患者能检测到EGFR基因突变，而其中L858R点突变更常见，而对于那些无吸烟史的肺腺癌亚洲女性患者，这项比例高达50～60%［12］。该研究中，细胞蜡块标本和组织活检标本突变率分别为48%和52%，后者较前者多检出1例，两者差异无统计学意义，这可能与脱落细胞学蜡块肿瘤细胞含量较少无法提取足够的DNA样本有关，证实两者都为合适的分子检测标本来源。

综上所述，对于无法进行手术又难以获得病理组织活检标本的临床晚期肺癌患者，胸水细胞蜡块可以替代组织活检标本，为患者的病理诊断及分子检测提供依据。