猪伪狂犬病病毒HNJY株的分离鉴定及其基因序列分析

张中华 ， 吴凤笋 ， 吕玉金 ， 刘玲玲 ， 张世军 ， 李文刚

(1.河南农业大学牧医工程学院 ， 河南 郑州 450002 ； 2.河南牧业经济学院动物医药学院 ， 河南 郑州 450046)

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种家畜和野生动物的一种急性、热性传染病，主要临床症状为发热、奇痒、急性脑脊髓炎和繁殖障碍[1-2]。猪是PRV唯一的自然宿主和储存宿主，造成妊娠母猪流产，产死胎或木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率，给养猪业造成极大的经济损失[3-4]。

2011年底，我国PR疫情出现了新的变化[5]，许多免疫过PRV疫苗的猪场和野毒抗体检测阴性的猪场，甚至是一些已经宣布净化PRV的猪场都出现了PR的疫情。为了解PRV的流行趋势及变异情况，本试验对2018年采集于河南省济源市某猪场的疑似猪伪狂犬病病料组织，进行PRV分离鉴定，以期获得PRV分离株的生物学特性，为有效防控PR提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料、阳性毒株、细胞及实验动物 病料组织于2018年1月采集自河南省济源市某猪场疑似感染PRV的病猪；PRV阳性对照毒株Min-A株、猪肾细胞(PK-15)由本实验室保存；6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠，购自郑州大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 pMD18-T Vector(2 692 bp)、ExTaq酶、Primer STAR GXL DNA Polymerase，均购自宝生物工程(大连)有限公司；HiPure Viral RNA/DNA Kit，购自广州美基生物科技有限公司；5×All-In-One RT Master Mix，购自Abcam公司；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×GC-Rich PCR Master Mix、Tailing-A Reaction Kit，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病料组织的采集与处理 在无菌条件下取疑似患猪伪狂犬病病死猪的肺、肾、脾、脑等组织，按1∶5加入PBS充分研磨制成悬液。反复冻融3次，4 ℃，4 000 g离心15 min，取上清经0.22 μm滤膜过滤后放-80 ℃备用。

1.2.2 引物设计与合成 PRV、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、圆环病毒2型(Circovirus type 2，PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)和猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)的鉴定引物为本实验室保存[6]。参照GenBank中发布的PRV序列(登录号：JF797219.1)设计4对引物分别扩增PRVgE、gB、gD、TK基因，参考文献[7]合成引物扩增gC基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 病料组织的PCR鉴定 用HiPure Viral RNA/DNA Kit提取病料组织的RNA/DNA，按照Abcam公司RNA反转录试剂盒说明书获取cDNA。以提取的DNA或cDNA为模板进行PRV、PPV、PCV2、PRRSV、JEV和CSFV的 PCR鉴定。

1.2.4 病毒的分离与纯化 将处理过的组织病料上清经0.22 μm滤膜过滤并经双抗过夜处理后，接种至PK-15细胞，待细胞病变(Cytopathic effect，CPE)达到80%时收毒。经PCR鉴定，3轮空斑纯化后，在PK-15细胞上传代至稳定出现CPE时收毒。

1.2.5 分离株半数组织培养感染剂量(Tissue culture infectious dose 50，TCID50)的测定 取分离株病毒液用细胞维持液作连续10倍稀释，按100 μL/孔接种到96孔细胞培养板上，并设阴性对照，观察至第4～5天。记录细胞出现CPE孔数，取3次重复试验的平均值，按照Reed-Muench两氏法计算病毒的TCID50值。

1.2.6 分离株对小鼠的致病性试验 将48只6周龄BALB/c雌性小鼠随机分成6组，分别接种106.71、105.71、104.71、103.71、102.71TCID50/0.1 mL病毒液，同时接种DMEM作阴性对照，接种剂量均为100 μL/只，记录小鼠的死亡情况，计算分离株的半数致死量(Median lethal dose，LD50)。

1.2.7 分离株gE、gB、gC、gD及TK基因的克隆、测序鉴定及序列分析 以Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒提取纯化的病毒DNA，以此为模板扩增gE、gB、gC、TK、gD基因。将各基因扩增产物用1%(gE、gB)或1.5%(gC、gD和TK)琼脂糖凝胶电泳检测，并进行胶回收纯化；由于本试验使用的高保真酶扩增的目的片段为不带A尾的平末端DNA片段，因此需对目的片段加A后，克隆入pMD18-T Vector。经将双酶切鉴定为阳性的gE、gB、gC、gD、TK重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

用DNASTAR.Lasergene.v 7.1中的MegAlign与GenBank中收录的国内外其他PRV毒株的gE、gB、gC、gD、TK基因序列进行比较分析，并使用MEGA 7软件中的Neighbor-Joining方法构建氨基酸进化树，分析PRV分离株的遗传序列特性。

2 结果

2.1 病料组织中PRV的PCR鉴定 以病料中提取的DNA为模板，用PRV鉴定引物进行扩增，得到1条约166 bp的条带，与阳性对照Min-A株得到的条带大小一致，如图1；以DNA和cDNA为模板进行其他病原的鉴定，分别得到152、198 bp和91 bp的目的片段，如图2。结果表明，病料中不仅有PRV感染，同时有PPV、PRRSV和CSFV混合感染。

图1 病料组织中PRV的PCR鉴定Fig.1 Identification of PRV in diseased tissue by PCRM：DL-500 DNA相对分子质量标准； 1：阳性对照(Min-A株)；2：待检病料； 3：阴性对照M：DL-500 DNA marker； 1：Positive control (Min-A strain)； 2： Diseased tissue； 3：Negative control

图2 病料组织中其他病原的PCR鉴定Fig.2 Identification of other pathogens in diseased tissue by PCRM：DL-500 DNA相对分子质量标准； 1：PPV； 2：PCV2；3：PRRSV； 4：JEV； 5：CSFVM：DL-500 DNA marker； 1：PPV；2：PCV2； 3：PRRSV； 4：JEV； 5：CSFV

2.2 病毒的分离与纯化 将处理过的病料组织接种至PK-15细胞，1～2 d后出现明显的细胞病变。用甲醛结晶紫溶液对病毒进行空斑染色，对空斑纯化后的病毒液进行PCR鉴定，扩增出1条约166 bp的特异性条带，如图3，与预期结果一致，成功分离到1株PRV毒株，命名为HNJY。

图3 空斑纯化细胞毒液PRV鉴定Fig.3 Identification of pathogens alter PRV cellsM：DL-500 DNA相对分子质量标准； 1：阳性对照； 2：空斑纯化后细胞上清； 3：正常细胞上清M：DL-500 DNA marker； 1：Positive control； 2：Cell supernatant inoculated with PRV； 3：Normal cell supernatant

2.3 分离毒株滴度测定 HNJY株病毒液连续10倍稀释，按100 μL/孔接种到96孔细胞培养板上，连续观察记录，10-1～10-8稀释全部出现CPE，10-9稀释有2个孔出现CPE，10-10稀释无细胞病变。采用Reed-Muench两氏法计算测得分离病毒的TCID50值为108.7/0.1 mL。

2.4 分离株HNJY对小鼠的致病性试验 TCID50为106.71/0.1 mL感染组小鼠在注射后46 h开始出现临床症状，52 h开始死亡，86 h内全部死亡；105.71/0.1 mL感染组121 h内死亡5只，其余存活；104.71/0.1 mL感染组在118 h内死亡2只，其余存活；103.71/0.1 mL、102.71/0.1 mL和对照组小鼠无死亡。具体情况见表1。采用Reed-Muench两氏法计算HNJY株对小鼠的LD50为105.31TCID50/0.1 mL。以上感染死亡小鼠均出现奇痒、脱毛、抓咬注射部位、注射部位溃烂等症状。

表1 HNJY株LD50的测定Table 1 Determination of LD50 of HNJY strain

2.5 分离株gE、gB、gC、gD和TK基因的扩增gE、gB、gC、gD和TK基因的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图4。分别得到约2 061、2 877、1 696、1 367 bp和1 139 bp的目的条带，与预期结果一致。

图4 PRV gE、gB、gC、gD及TK基因全长的扩增Fig.4 Full-length amplification of PRV gE、gB、gC、gD and TK gene M1：DL-5 000 DNA相对分子质量标准； M2：DL-2 000 DNA相对分子质量标准； A：gE； B：gB； C：gC； D：gD； E：TK； 1：HNJY株； 2：阳性对照(Min-A株)M1：DL-5 000 DNA marker; M2: DL-2 000 DNA marker； A：gE； B：gB； C：gC； D：gD； E：TK； 1: HNJY strain; 2: Positive control (Min-A strain)

2.6 分离株gE、gB、gC、gD、TK基因核苷酸及氨基酸序列同源性分析 分离株gE、gB、gC、gD、TK基因核苷酸及氨基酸与欧美毒株和国内分离毒株进行比较分析。结果显示：HNJY分离株的gE、gB、gD、gC基因与国内分离株同源性要高于欧美毒株，gC基因与2011年之后分离的国内变异株同源性更高一些，TK基因与国内外毒株同源性高，该基因保守性高，见表2、3。

表2 HNJY株与参考毒株gE、gB、gC、gD、TK基因核苷酸序列同源性比对Table 2 HNJY strain and reference strains gE,gB,gC,gD,TK gene nucleotide sequence homology alignment (%)

表3 HNJY株与参考毒株gE、gB、gC、gD、TK基因氨基酸序列同源性比对Table 3 HNJY strain and reference strains gE,gB,gC,gD,TK gene amino acid sequence homology alignment (%)

2.7gE、gB、gC、gD、TK基因氨基酸遗传进化分析 根据GenBank中已发表的19株国内外参考毒株运用MEGA 7软件使用Neighbor-Joining方法进行氨基酸进化树分析。结果显示：HNJY株gE、gB、gC、gD基因与欧美毒株在不同的大分支，亲缘关系最远，与国内2011年以前分离的毒株同在1个大分支上，与2011年以后分离的毒株亲缘关系最近；TK基因与来自不同分离年代及地点的PRV分离株亲缘关系均较近，说明TK基因保守性高，见图5。

图5 gE、gB、gC、gD、TK基因氨基酸进化树Fig.5 Amino acid evolution tree of gE,gB,gC,gD and TK genesA:gE; B:gB; C:gC; D:gD; E:TK

2.8gE、gB、gC、gD基因氨基酸序列分析 分离株HNJY株与国内分离毒株氨基酸相比只有gD基因在256位由丙氨酸突变为苏氨酸，gE、gB、gC基因氨基酸与国内分离毒株没有变化。与欧美毒株比较gE氨基酸序列有14处差异，gB氨基酸序列有15处差异，gC基因氨基酸序列有6处差异，gD基因在344位由谷氨酰胺突变为脯氨酸，在348位由脯氨酸突变为苏氨酸。

3 讨论

本试验分离株HNJY株的TCID50为10﹣8.7/0.1 mL，刘正飞等[8]与陈焕春等[9]测定的国内毒株Min-A株和Ea株的TCID50分别为10﹣7.9/0.1 mL 和10﹣8.08/0.1 mL，说明HNJY株与经典毒株Ea株和Min-A株的TCID50相当，说明近些年PR的流行与PRV的毒力没有关系。通过腹股沟皮下注射小鼠测得LD50为105.31TCID50，Luo等[10]测得TJ株和SC株的LD50分别为102.3TCID50和103.3TCID50；向柯宇[11]测得HeN1株的LD50为102.37TCID50，说明分离株HNJY的致病力相对较弱。

HNJY株与国内外参考毒株序列同源性比对结果分析表明：HNJY株gE、gB、gC、gD基因与国内毒株的同源性均高于欧美毒株，且分离株HNJYgC基因与2011年之后的国内毒株同源性均高于2011年之前国内分离毒株，说明HNJY株属于近年来国内变异株。HNJY株与国内外参考毒株氨基酸序列分析结果显示：gE氨基酸在59、63、106、149、179、181、215、216、472、474、504、509、522、526位(以中国毒株位置为准)与欧美毒株有差异，与陈超[12]研究欧美毒株和亚洲毒株的氨基酸差异分析结果一致，说明这些差异可以作为鉴别PRV亚洲毒株和欧美毒株的标志。gE基因是PRV主要的毒力基因，氨基酸的差异对PRV毒力的影响，还需进一步的研究。gB氨基酸分析表明，中国毒株和欧美毒株在53、55、70、81、82、83、87、93、94、96、102、557、678、847、854、856、915、921位(以中国毒株位置为准)有差异，推断这些差异可以作为gB基因鉴定国内毒株和欧美毒株的标志。gB基因是PRV的重要保护性抗原基因之一[13]，所以gB基因的氨基酸变化对其抗原性的影响如何，还待深入研究。gC氨基酸分析表明，亚洲毒株和欧美毒株在431、449、457、461、467、468位(以亚洲毒株位置为准)有差异，结果显示，氨基酸突变位点主要发生在431～468位。有研究表明，在436～470位氨基酸为gC蛋白跨膜区，其中含有α-螺旋结构的疏水区，这一区域作用是使PRV稳定附着在细胞表面[14]。但这一区域的氨基酸突变对PRV吸附的作用影响如何，还需进一步研究。gD氨基酸分析表明，国内分离株与5株欧美毒株相比，在344位由谷氨酰胺突变为脯氨酸，在348位由脯氨酸突变为苏氨酸。HNJY株与国内外参考毒株相比，在256位由丙氨酸突变为苏氨酸，但此氨基酸突变对PRV毒株生物学特性的影响还需进行深入研究。gE、gB、gC、gD、TK基因氨基酸进化树分析表明，gE、gB基因可以作为鉴别欧美毒株和亚洲毒株的标识基因，gC基因遗传距离与分离年代有一定联系，gD、TK基因遗传进化与分离年代没有关联。