鸦胆子油乳灌肠抗溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜损伤的作用及机理研究

王建波，路士华，王伟，王伟明

（山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011）

0 引言

溃疡性结肠炎（UC）是全球性疾病，由于其发病原因及机制尚不完全清楚，临床尚缺乏令人满意的治疗手段，该病缠绵难愈，易复发，且有癌变倾向，已被WHO 列为现代难治病之一[1-3]。大量文献资料及临床实践证实中医药治疗本病具有独特的优势[3-5]，所以深入探索中医有效方药，具有十分重要的理论及实践价值。课题组通过前期大量的临床观察，发现溃疡性结肠炎患者，特别是处于活动期的患者，多表现为热毒内盛的证候，基于此种临床现象，我们应用鸦胆子油乳保留灌肠治疗，在临床应用中取得了显著的效果。本研究旨在前期临床工作的基础上，进一步通过实验研究，观察鸦胆子油乳对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织损伤的修复，以及对结肠组织中IL-6、IL-10 及对TNF-α 含量的影响，以探讨鸦胆子油乳治疗溃疡性结肠炎的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料。清洁级Wistar 雄性大鼠60 只，鼠龄12 周，体重（280±25）g。购自山东大学医学院动物实验中心，实验动物合格证 SCXK（鲁）2016-0001。

1.2 受试药物。鸦胆子油乳注射液，生产企业：广州白云山明兴制药有限公司，批准文号：国药准字12054324Z，规格10 mL/支。美沙拉嗪肠溶片，生产企业：由佳木斯鹿灵制药有限责任公司生产，国药准字H19980148，规格0.25 g/粒。

1.3 试剂与仪器。2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS） 溶液（美国Sigma 公司），购于上海易佰聚经贸有限公司；大鼠TNF-α、IL-6、IL-10 检测试剂盒，均购自济南森艾狄生物科技有限公司；Allegra X-15R 离心机（美国Beckman Coulter Inc.）；DY89-II 电动玻璃匀浆机，（宁波新芝生物科技股份有限公司）；UV1902PC 紫外可见分光光度计：（上海奥析科学仪器有限公司）；ELx808 吸收光酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组与造模：适应性饲养大鼠1 周后随机分为6 组：正常对照组，UC 模型对照组，鸦胆子油乳低、中、高剂量组和西药对照美沙拉嗪组（以下简称正常组、模型组、鸦胆子油乳低剂量组、鸦胆子油乳中剂量组、鸦胆子油乳高剂量组、西药组）），每组10 只。造模前禁食24 h，留取10 只作为正常组，其余大鼠以2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，用双猪尾管从肛门插入，深度为8 cm，推入TNBS 溶液（含2.5% TNBS、50%乙醇）4 mL/kg 体重，捏紧肛门平放5 min 即可[6]。

1.4.2 给药方法：鸦胆子油乳注射液给药量：大鼠低、中、高剂量分别按成人用量的5 倍、10 倍、20 倍计算，即2.5 mL/kg，5 mL/kg，10 mL/kg 药物，用生理盐水配成250 mL/L，500 mL/L，1000 mL/L。西药组：大鼠剂量按成人10倍用药剂量，即0.5 g/kg，美沙拉嗪用生理盐水配成50g/L。造模成功后第3 天，将UC 模型动物分为模型组、鸦胆子油乳低剂量组、鸦胆子油乳中剂量组、鸦胆子油乳高剂量组、西药组，开始灌肠给药，给药量为l0 mL/kg 体重。正常组，模型组给等体积生理盐水，每天1 次，连续干预18 天。

1.4.3 标本采集：实验结束后各组小鼠禁食不禁水24 小时称体重后，均以颈椎脱臼法处死，取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段，剖开肠管，用冷生理盐水将结肠冲洗干净，用滤纸吸干后，观察各组大鼠结肠的大体改变；在病变最明显处取3 段长约1 cm 的小鼠结肠组织，福尔马林浸泡固定，以备制作病理切片；其余结肠剪短后置于1.5 mL 离心管中，-80℃冰箱中保存备用。

1.4.4 病理切片制作及组织学评分：结肠组织标本用10%福尔马林溶液浸泡固定，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，中性树脂胶封片，光镜下观察病理改变并进行组织学评分。组织学评分标准[7]：无损伤为0 分；肠壁粘膜少量炎细胞浸润，黏膜下充血或出血；为1 分；上皮覆盖不全或不成熟，黏膜层及黏膜下层大量慢性炎性细胞浸润为2 分；明显充血水肿，黏膜层及黏膜下层大量中性粒细胞浸润，隐窝肿坏死及溃疡形成为3 分。

1.4.5 检测指标：采用ELISA 法检测结肠组织中IL-6、IL-10、TNF-α 含量。

1.5 统计学分析。实验数据结果采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，差异比较用均值±标准差表示，组间比较采用t 检验法，P＜0.05 提示差异有统计学意义，P＜0.01 提示差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 结肠粘膜损伤情况。结果显示，模型组评分明显高于空白组，差异有显著统计学意义（P＜0.01），说明造模成功。鸦胆子油乳中、高剂量组及西药组评分均不同程度降低（P＜0.01 或P＜0.05），其中，高剂量组明显优于中剂量组及西药组，但与西药组之间比较无统计学意义（P＞0.05）。结果说明，各组均可减轻粘膜组织损伤，作用效果依次为高剂量组、中剂量组、西药组、低剂量组，结果见表1。

表1 各组组织评分比较

表1 各组组织评分比较

注：与正常组比较：●P＜0.01。与模型组比较：△P＜0.05，▲P＜0.01，＃P＞0.05。与美沙拉嗪组比较：£P＜0.05，■P＜0.01，※P＞0.05。

组别 组织评分正常组 0.20±0.42模型组 2.90±0.57●鸦胆子油乳低剂量组 2.50±0.71●＃£鸦胆子油乳中剂量组 2.20±0.79●△※鸦胆子油乳高剂量组 1.80±0.63●▲※西药组 2.00±0.67●△

2.2 结肠组织中IL-6、IL-10、TNF-α 含量测定结果。IL-6比较：与模型组比较，鸦胆子油乳中剂量组、鸦胆子油乳高剂量组、西药组差异特别显著（P＜0.01）。但与西药组比较，鸦胆子油乳中剂量组、高剂量组无显著差异（P＞0.05）。结果说明，各组均能有效降低IL-6 的表达，其中鸦胆子油乳低、中、高剂量组均能降低IL-6 的表达，且呈现一定的量效关系，高剂量组作用最为显著，优于西药对照组，但与西药组比较无统计学意义（P＞0.05）。IL-8 比较：与模型组比较，鸦胆子油乳低剂量组差异显著（P＜0.05），鸦胆子油乳中剂量组、鸦胆子油乳高剂量组、西药组差异特别显著（P＜0.01）。与西药组比较，低剂量组、中剂量组差异显著（P＜0.05），而高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。结果说明，各组均能有效增加IL-8 的表达，尤以中剂量组、高剂量组作用显著，其中高剂量组与西药组作用相当。TNF-α 比较：与模型组比较，鸦胆子油乳中剂量组、鸦胆子油乳高剂量组、西药组差异特别显著（P＜0.01）。与西药组比较，低剂量组、中剂量组差异有统计学意义（P＜0.05），而高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。结果说明，各组均能有效降低TNF-α 的表达，以中剂量组、高剂量组、西药组尤为显著，高剂量组与西药组作用相当，结果见表2。

表2 各组炎性指标比较，pg/mL）

表2 各组炎性指标比较，pg/mL）

注：与正常组比较：◎P＜0.05，●P＜0.01，＆P＞0.05。与模型组比较：△P＜0.05，▲P＜0.01。与西药组比较：£P＜0.05， ■P＜0.01，※P＞0.05。

组别/指标 IL-6 IL-8 TNF-α正常组 117.61±1.49 296.25±28.24 36.27±2.72模型组 200.95±4.18● 91.25±12.66● 80.22±4.31●低剂量组 178.71±1.84●△□ 126.25±14.92●△£ 62.38±3.95●△£中剂量组 147.71±3.02◎▲※ 206.25±11.45◎▲£ 42.61±5.01◎▲£高剂量组 131.98±2.16◎▲※ 257.50±18.52＆▲※ 49.11±4.44◎▲※西药组 141.28±3.91◎▲ 260.25±17.56＆▲ 52.38±3.13◎▲

3 讨论

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）为炎症性肠病，目前对本病的发病原因及机制尚不明确，多认为主要涉及免疫、感染、遗传等因素有关。中医学中并无溃疡性结肠炎此病名，从其临床表现特征来看，应归属中医学“休息痢”、“肠风”、“脏毒”等范畴，而其病因多与禀赋不足、饮食失节与情志内伤等有关[8]。其病机课题组从多年临床实践观察中总结认为，脾气亏虚为其始动因素，而湿、热、瘀、毒既是病理产物，又是本病反复发作，缠绵不愈的重要致病因素。依据此理论，我们针对溃疡性结肠炎活动期以热、毒等标实为突出矛盾的临床特点，我们采用鸦胆子油乳灌肠治疗取得了良好的临床效果。鸦胆子味苦、性寒凉，鸦胆子具有清热解毒、止痢的功效，切合病机，由于其具有腐蚀赘疣的作用，尤其适用于伴有炎性息肉的UC 患者。

中药鸦胆子为苦木科鸦胆子属植物鸦胆子（Brucea j avanica L.Merr.）的干燥成熟果实，该药材原植物主产于我国南方沿海热带和亚热带地区[9]。鸦胆子始载于清代赵学敏的《本草纲目拾遗》，具有清热解毒、截疟止痢、腐蚀赘疣的功效[10]。历史上我国民间广泛应用鸦胆子治疗痢疾等疾病，如张锡纯提倡用鸦胆子治疗痢疾，其在《医学衷中参西录》谓其“味极苦，性凉，为凉血解毒之要药，善治热性赤痢……最能清血分之热及肠中之热，防腐生肌，诚有奇效”[11]。鸦胆子油乳为鸦胆子果实中提取得到的脂肪油乳化制成，主要有效成分为油酸和亚油酸[10]，有研究表明具有抗肿瘤、提高机体免疫功能、抑菌、抗炎等多方面的生物活性，其油乳剂优点在于可以提高药物对皮肤 以及黏膜的穿透性并减轻药物对生理组织的刺激性[12-14]。

免疫机制在溃疡性结肠炎发病中的作用己得到医学界公认，其中细胞因子在肠道免疫反应中发挥着关键性的作用，肿瘤坏死因子、IL-6 和IL-8 等促炎症细胞因子被认为是的能介导溃疡性结肠炎发病的细胞因子，而一些细胞因子IL-4、IL-10 等则具有抗炎作用[15]。促炎与抗炎因子的平衡状态在溃疡性结肠炎的发病及发展过程中起到了非常重要的作用，并且与病情严重程度有关。检测TNF-a 的水平对UC 的诊断、活动情况及预后判定均具有重要意义，并可通过减少TNF-a、IL-6、IL-10 的表达或抑制生物学功能来治疗溃疡性结肠炎。

本项研究发现，鸦胆子油乳注射液具有明确治疗溃疡性结肠炎的作用，不仅可使溃疡性结肠炎模型大鼠的结肠黏膜得到明显修复与改善，并可升高结肠组织中细胞因子IL-10的含量，降低结肠组织中细胞因子IL-6 的含量，同时还能明显降低结肠组织中 TNF-a 的表达。由此推测，鸦胆子油乳注射液可能是通过抑制TNF-a 的表达，减弱了其作为启动因子的级联炎性反应链的扩大，减少促炎症介质的释放，增加保护因子的释放，发挥抗炎作用，从而发挥其治疗溃疡性结肠炎的作用。