姜黄素对卵巢癌细胞增殖、细胞迁移活性的影响及机制研究

陈佳权，艾恒玲，孙雪，苗慧

牡丹江医学院附属第二医院，黑龙江牡丹江 157000

卵巢癌因恶性程度高，发病隐匿，是妇科肿瘤中致死率最高的。 早期发现，早期肿瘤是改善预后的关键因素。目前手术，化疗方案治疗后有超过80%的患者复发，甚至危及生命。 近年来重要在防治卵巢癌中的作用日益受到重视，该文研究了姜黄素对卵巢癌细胞增殖、细胞迁移活性的影响，为姜黄素在卵巢癌治疗中的应用提供理论依据。

1 实验方法

1.1 分组方法

卵巢癌细胞复苏后，传代培养，实验组分为：对照组、低浓度组，中浓度组，高浓度组。 取5，50 ，100 PM 姜黄素分别加入卵巢癌SKOV3 细胞培养液中共同培养24 h。

1.2 MTT 法检测卵巢癌细胞增殖情况

在各组内随机选取细胞， 用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT 法) 分别在12 h、24 h、48 h 各时间点行细胞活性检测。 加入MTT（四甲基偶氮唑蓝）溶液，4 h 后加入溶解液波长490 nm 检测。 细胞存活率的计算：细胞存活率=试验组光吸收值/对照组光吸收值×100%。

1.3 应用Westernblot 法检测姜黄素干预后卵巢癌细胞Caspase-3 活性的变化

96 孔板每孔加入细胞裂解液，用BCA 法测定蛋白质浓度，配胶，上样，电泳，半干转膜，封闭，羊抗鼠Caspase-3多克隆抗体(1：800) 4℃孵育过夜，洗膜4 次，ECL 发光，感光胶片记录条带。 image J 软件分析。

1.4 TransweII 小室法检测SKOV3 细胞迁移能力

取l mL 细胞悬液置于Transwell 小室，37℃, 5%CO2浓度的恒温培养箱中孵育12 h， 甲醛固定后染色20 min后倒置显微镜下观察染色细胞， 计数移动至聚碳酸酯膜下层的细胞数。

1.5 姜黄素SKOV3 细胞MMP-9 分泌水平的影晌

姜黄素加入SKOV3 细胞培养液中， 培养24 h 后，ELISA 法测定细胞培养上清液中MMP-9 含量。

1.6 统计方法

用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，釆用t检验，单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四甲基偶氮唑盐比色法MTT 法检测卵巢癌细胞增殖情况

与对照组比较，各实验组A 值明显下降，细胞存活率下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。随时间进展各浓度组A值逐渐下降,48 h 与12 h 数值对比差异有统计学意义(P＜0.05)。 见表1。 提示姜黄素呈时间与浓度依耐性抑制卵巢癌细胞的增殖。

表1 姜黄素对卵巢癌细胞吸光度的影响[（x±s），A 值）]Table 1 The effect of curcumin on the absorbance of ovarian cancer cells[(x±s)，A value) ]

计算细胞的抑制率，计算方法：(1-实验组平均OD 值/对照组平均OD 值)×100%。发现50 μmol/L 组48 h 时作用最强，抑制率为(68.55±5.67)%。

2.2 Westernblot 法检测姜黄素干预后卵巢癌细胞Caspase-3 活性的变化

浓度梯度姜黄素组实验表明，随着姜黄素浓度增加，卵巢癌细胞Caspase-3 表达增加，诱导其凋亡。 各浓度姜黄素组Caspase-3 表达均高于空白对照组，其中50 μmol/L组48 h 时作用最强，与空白对照组相,差异有统计学意义（P＜0.05）。 见图1。

图1 Western blot 法检测卵巢癌细胞Caspase-3 活性Figure 1 Western blot analysis of Caspase-3 activity in ovarian cancer cells

2.3 Transwell 法检测姜黄素SKOV3 细胞体外迁移的影响

与对照组相比姜黄素组卵巢癌细胞从小室上层移动到下层的细胞数目明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示姜黄素可抑制卵巢癌细胞的体外迁移过程。 其中50 μmol/L，5 μmol/L 组姜黄素抑制迁移作用明显强于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05 )。 见图2。

图2 Transwell 法检测卵巢癌细胞体外迁移Figure 2 Transwell assay for ovarian cancer cell migration in vitro

2.4 姜黄素对SKOV3 细胞MMP-9 分泌水平的影晌

24 h 时姜黄素组SKOV3 细胞培养上清液中MMP-9的 含 量 分 别 为 （28.6±66）pg/mL、（22.5 士5.4）pg/mL 和(17.4±9.9)pg/mL，对照组为（48.1±3.8）pg/mL。 与对照组相比，姜黄素可显著降低SKOV3 细胞培养上清液中MMP-9的水平， 提示姜黄素可影响卵巢癌细胞MMP-9 分泌能力。 见表2。

表2 姜黄素对卵巢癌细胞培养液中MMP-9 浓度的影响[（x±s），pg/mL）]Table 2 Effect of curcumin on MMP-9 concentration in ovarian cancer cell culture medium [（x±s），pg/mL）]

3 讨论

卵巢位于盆腔， 发生恶性病变时常常到晚期时才被发现， 因此卵巢癌的病死率位居女性生殖系统恶性肿瘤第一位[1]。 目前的治疗以手术结合放疗化疗为主，但是五年生存率不足30%， 目前寻找卵巢癌治疗的新的靶点和治疗方法成为临床研究的热点。 一方面随着对卵巢癌发生发展分子生物学机制的研究， 侵袭相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases} MMPs)家族也受到了极大的关注[2]。 另一方面中药姜黄素因其毒性低、不良反应少的优点，并且具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用，通过多种途径发挥抗肿瘤的作用的特点， 是潜在的肿瘤的预防和治疗热点[3]。

肿瘤细胞的增殖、逃避凋亡是癌症的特性。Valentina,S 在2013 年研究发现姜黄素在体内及体外实验中均可以促进卵巢癌细胞凋亡、抑制其增殖，从而达到抗卵巢癌的作用[4]。 彭妲等人[5]在2012 年的研究中发现，MTT 法用酶标仪于490 nm 波长测吸光度值(OD 值)。 细胞的抑制率=(1-实 验 组 平 均OD 值/对 照 组 平 均OD 值)×100%。 80 μmol/L 组姜黄素在24 h 时对卵巢癌细胞增殖有明显抑制作用，抑制率最高到达（69.31±4.97）。 该实验中发现姜黄素呈时间与浓度依耐性抑制卵巢癌细胞的增殖， 其中50 μmol/L 组48 h 时作用最强，A 值（0.255±0.051），按照上述公式计算抑制率为（68.55±5.67）%，与以上研究结果一致。Yang, M[6].在2015 年研究发现姜黄素可以通过增加CD44的表达，进一步调控卵巢癌细胞的增殖，明显促进细胞凋亡。 Seu JA 等[7]在2016 年研究发现姜黄素可以抑制肌浆/内质网钙ATP 酶活性，从而增加细胞溶质Ca2+浓度，诱导卵巢癌细胞凋亡。 该实验进一步研究了姜黄素对卵巢癌细胞MMP-9 分泌的影响。

其他器官转移是恶性肿瘤的特征性表现， 是肿瘤危及患者生命的重要因素， 因此抗转移治疗方法始终是抗肿瘤治疗的热点。 已有研究表明肿瘤细胞侵袭及转移首先是破坏细胞外基质及基底膜结构[8]。 在这一过程中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase MMPs) 起到重要作用，其中基质金属蛋白酶9(MMP-9)与肿瘤侵袭、转移直接相关。MMP-9 是IV 型胶原酶，可降解基底膜IV 型胶原蛋白、弹性蛋白及细胞外基质，最终导致细胞外屏障结构破坏[9]。 正常情况时候，MMP-9 等基质金属蛋白酶类是由炎性细胞、上皮细胞、巨噬细胞产生的，以无活性的酶原形式分泌到细胞外，原癌基因、细胞因子等可激活MMPs 并转化为具有降解活性的酶[10]。 血清肿瘤标志物因其创伤小、操作简单、检测结果可靠等优点成为目前临床上广泛应用的肿瘤检测指标， 经过多个实验研究表明血清肿瘤标志物可准确地反映肿瘤情况。 李小坤等[11]在2016 年的研究中发现在卵巢癌组织中检测到MMP-9 的表达水平明显高于正常对照组，并且在与癌症程度相关，及癌症程度越重肿瘤组织中MMP-9 表达越高，说明卵巢恶性细胞可以分泌或诱导其他细胞分泌MMP-9。 该研究发现姜黄素可降低卵巢癌细胞培养上清中MMP-9 的含量，提示姜黄素抗卵巢癌细胞迁移机制可能是通过这一途径实现的。 有研究表明该抗迁移机制可能与抑制细胞内NF-oB和AP-1 的活化有关。

该实验结果提示姜黄素可显著抑制卵巢癌细胞迁移，并通过调控MMP-9 分泌途径抑制卵巢癌细胞的侵袭活性。 该实验发现姜黄素抑制卵巢癌细胞增殖及迁移，可能与其诱导卵巢癌细胞凋亡，降低MMP-9 表达有关。 可进一步研究降低MMP-9 表达的信号转导路径。 如能明确姜黄素的作用机理， 可为中药在抗肿瘤的治疗方面提供理论依据。