HBV 相关肝细胞癌患者中LAIR-1 的表达变化及与T 细胞亚群和IL-10 的关系＊

薛国辉，孙亭立，王琴，淦勤，陈雪礼

（江西省九江市第一人民医院，1.检验科；2.肝胆外科；3.体检中心，九江332000）

肝细胞癌 （Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一[1,2]，亦是肿瘤相关死亡的主要原因之一，且其整体生存期较差，探究其病因学机理并找寻早期诊断标志物和新的治疗靶点对于HCC 诊疗尤为重要。 流行病学数据显示慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是HCC 发生发展最关键的风险因素，其在HCC 病因学中扮演重要角色[3,4]。 全球范围内约20 亿人感染HBV, 3.5 亿为HBV 携带者。 约15%-40%的HBV 感染者会发展为肝硬化、肝衰竭或HCC[5]。 慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）与HCC 发生发展存在显著相关性,长期的炎症刺激可导致正常肝脏细胞结构和功能的变化， 进而形成肿瘤[6]。基础和临床研究发现免疫平衡紊乱即免疫抑制效应主导在HBV 相关HCC 的启动和进展中发挥关键生物学效应[7]。 白细胞相关免疫球蛋白样受体1（Leukocyte -associated immunoglobulin - like receptor-1，LAIR-1）属于免疫球蛋白超家族，是一类抑制性胶原受体，广泛表达于多种免疫细胞，如T 细胞、B 细胞以及单核细胞等[8]，也可从细胞膜表面脱落至血清中成为可溶性LAIR-1。 先前研究发现其在上皮性卵巢癌、 宫颈癌以及口腔鳞癌患者中表达异常，且与肿瘤侵袭转移相关。 然而关于其是否在HBV 相关HCC 患者循环外周血中存在异常，目前鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017 年7 月-2019 年10 月于九江市第一人民医院肝胆外科就诊且经病理组织学确诊的HCC 患者31 例, 且病原学证实为HBV阳性，其中男18，女13 例,年龄38-66 岁,中位年龄52 岁。 诊断依据2014 版《肝细胞癌规范诊治流程评价》[9],排除其他脏器严重疾病患者以及合并肝静脉、下腔静脉以及胆管癌等并发症的患者。选取25例CHB 患者作为良性疾病对照组, 其中男16 例，女9 例，年龄36-65 岁,中位年龄52 岁；同时选取同期于本院体检中心行健康体检的人群25 例作为健康对照组（HC）,其中男17 例,女8 例,年龄37-69 岁,中位年龄53 岁。 对照组人群排除肝脏以及其他脏器严重疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病等。

1.2 标本采集及处理 抽取HCC 患者术前以及健康体检者清晨空腹静脉血各6ml， 平均分装于2管。 其中一管于红盖干燥管中，室温静置20min 后4000rpm，10min 离心后分离血清于-80℃冰箱冻存，用于血清可溶性LAIR-1（sLAIR-1）以及白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）的测定。 另一管分装于紫盖EDTA 抗凝管中，立即送检，用于流式细胞术检测外周血T 细胞亚群， 在2h 内完成检测。

1.3 试剂、 仪器及测定 试剂： 人LAIR-1 ELISA Kit（ No. ABIN417568）购自德国antibodies-online公司， 其测试线性范围为0.31-20ng/ml。 人IL-10 ELISA Kit（D1000B）购自美国R&D 公司，其测试线性范围为7.8-500pg/ml。人CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5 T 细胞亚群检测试剂盒（6607013）购自美国贝克曼库尔特公司。 仪器：科华ST-360 酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）；FC500 贝克曼流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）。 测定： ⑴LAIR-1 和IL-10 测定严格依据ELISA 试剂盒说明说执行； ⑵T 细胞亚群测定：混匀外周血，取50μl 于流式检测管底部，防止血液沾染管壁；加10μl T 细胞亚群混合抗体，混匀；室温避光孵育15min； 加500μl 溶血剂室温避光10min裂解红细胞；1200rpm 5min 离心去上清； 加2ml PBS 混匀后，1200rpm 5min 离心去上清； 加500μl PBS 混悬后上机检测。依据FSc-SSc 设门圈定淋巴细胞， 再逐步分析CD3+、CD3+CD4+以及CD3+CD8+细胞比例。

1.4 统计学分析 所有研究数据以SPSS 20.0 统计软件和Graphad prism 8.0 软件处理，Kolmogorov-Smirnov 法检测数据的正态性； 符合正态分布的计量资料采用均数±标准差的形式表示，两样本均数比较采用独立样本t 检验，两个以上样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验；不符合正态分布的计量资料以中位数P50(P25,P75)形式表示，组间比较采用非参数检验。 计数资料采用百分数表示，组间差异采用卡方检验。 Spearman相关性用于分析各指标间的相关性。 以P<0.05（双侧）视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组人群sLAIR-1、T 细胞亚群以及IL-10 的差异 经KS 正态性分布检验显示3 组人群sLAIR-1、T 细胞亚群以及IL-10 均符合正态分布，采用单因素方差分析比较组间差异， 结果显示：sLAIR-1 在3 组人群间存在显著差异，LSD 两两检验显示HCC 患者sLAIR-1 浓度显著高于CHB 和HC；IL-10 在HCC 患者中显著上调， 而CHB 患者则显著下降；HCC 患者CD3+CD4+T 比例显著高于CHB 和HC；而CD3+CD8+T 比例在3 组间无显著差异；CD4+T/CD8+T 比值在HCC 中显著下降， 低于CHB 和HC。 见表1。

2.2 sLAIR-1 与HCC 临床病理组织学参数间的关系 分别依照HCC 患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移与否、是否肝硬化以及TNM 分期将患者分组，进一步统计学分析血清sLAIR-1 的差异。 分析结果显示血清sLAIR-1 在不同性别、 不同年龄以及肿瘤大小组间无统计学差异（P 均>0.05）。 进一步分析发现血清sLAIR-1 在淋巴结转移患者中显著高于未转移患者； 在肝硬化患者中亦显著高于未发生肝硬化的患者； 且晚期患者高于早期患者，见表2。

表1 3 组人群sLAIR-1、T 细胞亚群以及IL-10 的差异比较

表2 HCC 患者血清sLAIR-1 与临床病理学参数间的关系

2.3 sLAIR-1 与T 细胞亚群以及IL-10 的相关性Spearman 相关性分析结果显示HCC 患者血清sLAIR-1 与IL-10 浓度间呈显著正相关性 （r=0.5105，P=0.0033）； 而与CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 以及CD4+T/CD8+T 间相关性均不显著。

3 讨论

虽然随着外科手术以及化疗技术等HCC 治疗手段的不断发展， HCC 患者生存期有所提升，但晚期患者往往丧失了手术机会以及不断出现的化疗耐受等现象导致肿瘤复发，最终治疗失败[2]。 发掘HCC 中的异常分子并弄清HCC 免疫学机理对于发掘新的生物标志物以及开发新的靶向治疗方案尤为重要，目前国内外大量研究聚焦于此。

LAIR-1 自发现以来被认为主要表达于免疫细胞表面， 也表达于诸如CD34+造血祖细胞、MK细胞以及破骨细胞等其他类细胞表面[10]。 LAIR-1主要生物学功能为负性调控免疫反应和细胞分化， 此外作为胶原的配体其也可以调控胶原的代谢和沉积[11]。 其在肿瘤中的研究较少， 目前仅有Wang Y 等[12]发现在宫颈癌患者肿瘤组织中LAIR-1 高表达， 其表达情况与肿瘤进展相关。 此外，Yang LL 等[13]利用组织芯片发现口腔鳞癌患者组织中LAIR-1 异常高表达， 且与病理学分级相关。这与本研究中发现的HCC 患者sLAIR-1 升高且与淋巴结转移以及TNM 分期密切相关的结果一致， 提示LAIR-1 亦可能参与了HCC 的发生发展过程。但在急性淋巴细胞白血病患者中Singh M 等学者利用流式细胞术发现LAIR-1 显著低表达，这与Perbellini 等[14,15]在慢性淋巴细胞白血病患者中发现的结果类似。 这可能提示血液肿瘤患者LAIR-1 的表达由于血液细胞的变化而下降，这与实体肿瘤存在显著区别。

此外，本研究还发现CHB 患者sLAIR-1 相较对照组亦显著升高， 这可能提示LAIR-1 参与了HBV 与 肝 脏 的 炎 症 反 应 过 程。 María Martínez-Esparza 等[16]学者就发现肝硬化患者外周血单核细胞表明LAIR-1 表达显著上调，且在早期肝硬化患者中就已经出现异常高表达现象，表明LAIR-1 是肝硬化中慢性炎症导致的肝损伤的新型生物标志物。这一结果连同本研究结果提示LAIR-1 可能参与了CHB-肝硬化-HCC 的全过程。另外，本研究还发现出现肝硬化的HCC 患者其sLAIR-1 显著高于未出现肝硬化的HCC 患者。 既往研究报道多种肿瘤胶原表达显著上调， 且与不良的临床结局相关， 而胶原的过表达是通过LAIR-1 受体实现的。出现肝硬化的HCC 患者其胶原表达量更高， 因此可能伴随了sLAIR-1 的高表达。 另外，相关性分析发现HCC 患者血清sLAIR-1 与免疫抑制性细胞因子IL-10 呈显著正相关性， 但与CD3+T 细胞亚群相关性不显著。Yang LL 在口腔鳞癌患者中也发现LAIR-1 与免疫抑制性细胞髓源性抑制细胞和抑制性免疫检查点分子B7-H3 和VISTA 存在显著相关性[14]。 这些结果提示LAIR-1 在HCC 中可能发挥免疫抑制效应。

总之，本研究初步发现HCC 患者血清sLAIR-1 异常上调，并与肿瘤分期及是否发生肝硬化存在关联， 且与免疫抑制性细胞因子IL-10 显著相关，提示其可能参与HCC 的发生发展过程。