药品检验用计数培养基配制、灭菌及贮藏研究

戴宇婷 赵晓星 张金玺

作者单位：昭通市食品药品检验所药品微生物室，云南 昭通657000

微生物培养基是专供微生物生长繁殖使用的混合营养制品，一般都含有碳源、氮源、无机盐以及生长因子和水等。作为科学研究和应用科学的重要支撑条件，发挥着其他手段不可替代的作用[1]。培养基质量是微生物学检验的基础，其质量优劣可影响检验结果的准确性和可靠性[2]，培养基的配制、保存尤为重要[3]。为保证微生物生长、分离及鉴定等过程可靠，试验结果准确，需保证所用培养基质量可靠、制备方法适宜、灭菌过程和贮藏条件等通过质量控制试验。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证[4-5]，本试验通过对培养基配制、灭菌和贮藏进行验证，使整个过程受控，通过定期的稳定性检查确定了培养基的贮藏条件及贮藏期限，确保所配制的培养基可满足药品微生物检查的要求。

1 材料与仪器

1.1 培养基

培养基（北京三药科技开发公司）：胰酪大豆胨琼脂培养基TSA、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA、玫瑰红钠琼脂培养基、R2A琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基TSB、沙氏葡萄糖液体培养基SDB，批号分别为：1612232、160913、150625、151215、160712、151102。中国食品药品检定研究院：R2A琼脂对照培养基、沙氏葡萄糖琼脂对照培养基、玫瑰红钠琼脂对照培养基、胰酪大豆胨琼脂对照培养基，批号分别为：135027-201401、135013-201502、135005-201404、135025-201603。

1.2 菌种

中国食品药品检定研究院：黑曲霉 [CMCC（F）98 003]、白色念珠菌 [CMCC（F）98 001]、金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26 003 ]、铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10 104]、枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63 501]，传代次数均未超过5代。

1.3 仪器设备

生化培养箱LRH-250F（上海一恒科技有限公司），恒温水浴锅HH-S24（金坛市大地自动化仪器厂），生物安全柜BHC-1300ⅡA2（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-75G（上海博迅实业有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌至TSB中，35℃培养24 h；接种白色念珠菌至SDB中，25℃培养3 d；接种黑曲霉至SDA上，25℃培养7 d，用5 mL无菌0.9%氯化钠溶液将孢子洗脱转移至无菌试管内。取上述培养物，用无菌0.9%氯化钠溶液制成每1 mL含菌或孢子数≤100 CFU的菌或孢子悬液，备用。

1.4.2 培养基的制备 根据各培养基包装上的使用说明进行制备、分装，置压力蒸汽灭菌器中，121℃、0.14 MPa灭菌15 min。

1.4.3 培养基的贮藏 灭菌后的培养基2～8℃避光贮藏，贮藏效期30 d。灭菌后贮藏的凝固培养基，置于恒温水浴锅中沸水浴加热（1次再融化），待培养基完全融化温度降至不超过45℃使用。

1.5 监控项目

1.5.1 pH值测定 测定各培养基灭菌后的pH值（冷却至室温25℃测定）。试验3次。

1.5.2 适用性检査试验 每一试验菌株平行制备2个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行试验，并做待检培养基及对照培养基空白对照。取平均值。分别进行3次独立试验。

表1 pH值检查结果

表2 胰酪大豆胨琼脂培养基适用性检査试验结果

表3 沙氏葡萄糖琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、R2A琼脂培养基适用性检査试验结果

2 结果

各培养基pH值均未超过（规定值±0.2），均在规定范围内（玫瑰红钠琼脂培养基pH值未做要求）。菌液回收率=（被检培养基上的菌落平均数/对照培养基上的菌落平均数）×100%。回收率均在50%～200%范围内。且被检培养基上的菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，阴性对照试验均无菌生长。见表1、表2和表3。

3 讨论

3.1 人员操作

检查过程中任何检查程序出现操作不当[6]，都将影响结果的准确性。本试验进行的3次操作分别由接受过相关培训的不同试验人员独立按照标准操作程序进行，确保将人员对试验影响降到最低[7]。

3.2 培养基的选择

与2010版药典相比，2015年版中国药典对微生物限度检查的洁净环境、培养基及检查方法进行了修订[8]，修订后的微生物限度检查方法与欧美药典基本一致[9]。其中计数培养基将营养琼脂、玫瑰红钠琼脂培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，修订为胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基；并在工艺用水微生物限度计数中，引入了R2A琼脂培养基[10]。玫瑰红钠琼脂培养基因其具有的选择性，仍然保留作为当沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求时使用的备选培养基之一[11]。

3.3 灭菌操作

灭菌设备及参数对培养基有较大影响，本试验采用湿热灭菌法，所使用的高压灭菌器经过性能确认，并定期检定及验证；灭菌参数均严格按照各培养基的使用说明进行设定为温度121℃、压力0.14 MPa，灭菌15 min。保证培养基中营养成分不被破坏，避免培养基中其他物质因高温发生反应而影响其质量[12]。

3.4 不同培养基的适用性检查

市场上脱水培养基厂家很多，厂家不同、批号不同，对培养基的质量有显著影响。更换生产商，需重新进行验证。根据《中国药典》2015年版四部（9203）规定，通过本次验证试验，培养基的整个配制、灭菌过程受控，每一个批号的脱水培养基只需进行一次适用性检查，更换其他批号培养基也需重新进行验证。

3.5 贮藏条件

2～8℃、避光，所用医用冷藏箱定期校验，只再融化1次并未对培养效果造成明显影响。若培养基贮藏条件改变需另行验证贮藏条件、贮藏效期等。

综上所述，据试验结果，各培养基根据其包装上的使用说明制备，121℃、0.14 MPa灭菌15 min，培养基的pH值及适用性检查均符合规定，在试验贮藏期限30 d内符合规定。