喉癌患者PAC-1、CD62P 表达与临床病理特征和复发的关系

胡谊容 田松明 赵福容

喉癌是我国最常见的头颈部肿瘤之一[1]，喉癌的生存率、无癌生存期及喉功能的保留在很大程度上与喉癌诊断时所处的临床分期密切相关[2]。早期喉癌5 年生存率较高，部分地区可达80%以上[3]。虽然近年喉癌在诊治方面取得了长足发展，但是其复发率仍然较高，术后复发、淋巴结转移及远处转移是导致喉癌治疗失败的主要原因，同时也是影响患者预后的主要因素[4]。有研究显示，血小板活化状态与肿瘤的发生、发展密切相关，其中血小板粘附因子和释放物质起到了关键作用[5]。血小板表面血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 纤维蛋白原受体（platelet membrane glycoprotein Ⅱb/Ⅲa fibrin original receptor, PAC-1）和血小板P-选择素（platelet P-selectin, CD62P）分别是血小板早期和晚期活化标志物，介导肿瘤细胞与血小板结合，刺激新生血管的形成，从而促进肿瘤细胞的种植、转移、侵袭等[6]。但是鲜少见有研究分析PAC-1 和CD62P 与喉癌复发、转移的相关性。本文拟通过对比喉癌患者和健康受试人群PAC-1和CD62P 表达的差异，结合患者的临床病理特征和术后随访资料，以明确PAC-1 和CD62P 与喉癌的淋巴结转移及复发的相关性。现报告如下。

资料与方法

1 一般资料

选择2014 年1 月～2015 年12 月间在我院耳鼻咽喉科手术治疗的116 例喉癌患者为实验组，其中男性101 例，女性15 例；年龄42～71 岁，平均（56.6±5.9）岁。按2012 年UICC 进行临床分期：I 期24 例，II 期41 例，III 期35 例，IV 期16 例，颈淋巴结转移及远处转移31 例，复发19 例。所有患者均经喉部、颈部CT 及电子喉镜检查。入选标准：①经病理学确诊为鳞状细胞癌；②术前未接受化疗、放疗或其他抗肿瘤治疗；③患者签署知情同意书。排除合并其他恶性肿瘤、免疫系统、心脑血管疾病、严重肝肾功能不全、急慢性感染者。另外选取同时期我院健康体检者60 例作为对照组（与入组患者年龄、性别构成相匹配），其中男性52 例，女性8 例，年龄42～67岁，平均（54.2±7.4）岁。两组一般资料比较，无明显统计学差异（P>0.05），具有可比性。

2 方法

2.1 标本收集

所有患者抽取晨起空腹静脉血5ml，收集到EDTA 抗凝试剂管中。以德国Hermle Z200A 小型离心机低速离心（3000r/min）15min，离心半径10cm，离心后提取富含血小板血浆2ml 置于-20℃冰箱保存备用。

2.2 PAC-1 和CD62P 检测

采用流式细胞术通过单抗免疫荧光标记测定特异性荧光抗体结合血小板阳性率来检测PAC-1和CD62P 的表达水平。首先将富含血小板的血浆10μL 以及10μL CD61-PerCP、FITC-PAC-1、PECD62P 单克隆抗体（购自法国Immunotech 公司）加入实验试管中，另加富含血小板的血浆10μL、FITC/PE 标记的IgG（购自法国Immunotech 公司）同型对照管，两试管中各加入PBS 液30μl 混匀,室温避光保存20min 后以1%多聚甲醛PBS 液固定。采用流式细胞仪（美国Coulter 公司）检测，光源为488nm氦氖激发光，开始前以前向角、侧向角的散射光信号对血小板群设门，同型对照作为阴性群，每次检测10000 个血小板，结果以血小板表面表达PAC-1或CD62P 的阳性百分率表示。

3 随访

116 例患者均建立病例随访档案，术后对肿瘤组织进行病理检查，每3 个月通过电话或门诊随访，记录复发和转移情况，随访≥2 年，未有患者死亡，随访率为100%。随访至2018 年9 月30 日。

4 统计学分析

所得数据均录入SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间的比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用方差分析，进一步组间两两比较以SNK-q 检验。采用单因素和多因素Logistics 回归模型分析影响喉癌患者复发的因素。P<0.05 表明差异有统计学意义。

结果

1 两组受试对象PAC-1 和CD62P 阳性表达率比较

喉癌患者的PAC-1 和CD62P 阳性表达率分别为（17.82±1.76）%和（22.87±3.13）%，明显高于健康人群，差异有统计学意义（P<0.05）。而且经Pearson相关性分析，实验组患者PAC-1 表达和CD62P 表达呈正相关性（r=0.238，P<0.05）。见表1、图1。

表1 两组PAC-1 和CD62P 阳性表达率比较（±s）

表1 两组PAC-1 和CD62P 阳性表达率比较（±s）

组别 例数（n） PAC-1(%) CD62P(%)实验组 116 17.82±1.76 22.87±3.13对照组 60 3.79±0.54 18.31±1.95 t-60.227 10.291 P 值 - 0.000 0.000

2 喉癌患者PAC-1、CD62P 阳性表达率与患者病理特征的关系

喉癌患者的PAC-1 和CD62P 阳性表达率与患者肿瘤的T 分期、淋巴结转移（N 分期）、远处转移有关，T 分期和N 分期越高，PAC-1 和CD62P 阳性表达率越高，差异有统计学意义（P<0.05）。另外远处转移组PAC-1 和CD62P 阳性表达率高于未发生转移组，差异亦存在统计学意义（P<0.05）。喉癌患者PAC-1 和CD62P 阳性表达率与性别、年龄、临床分型、分化程度无关（P>0.05）。见表2。

表2 116 例喉癌患者PAC-1、CD62P 阳性表达率与临床病理特征的关系

3 喉癌患者PAC-1、CD62P 阳性表达率与喉癌复发的关系

随访期间有24 例患者复发，92 例患者未复发，复发率为20.69%。复发喉癌患者PAC-1、CD62P 阳性表达率分别为（17.02±0.85）%和（21.84±1.17）%，明显高于未复发的喉癌患者，差异有统计学意义（P<0.05）。另外局部复发患者、区域淋巴结转移患者、远处转移患者PAC-1、CD62P 阳性表达率比较未见统计学差异（P>0.05）。见表3。

表3 喉癌患者PAC-1、CD62P 阳性表达率与复发的关系

4 单因素和多因素Logistic 回归分析PAC-1 和CD62P 与喉癌复发的关系

以本研究中喉癌患者中性别、年龄、临床分型、分化程度、T 分期、N 分期、远处转移以及PAC-1、CD62P 指标作为自变量，以复发（局部复发、区域淋巴结转移、远处转移）进行单因素和多因素Logistic回归分析，T 分期、N 分期、远处转移、PAC-1 和CD62P 是喉癌复发的独立影响因素（P<0.05）。见表4。

表4 单因素和多因素Logistic 回归分析PAC-1和CD62P 与喉癌复发的关系

讨论

吸烟、饮酒、空气污染、病毒感染、长期接触石棉、芥子气、镍等化学物质以及慢性炎症等是喉癌发生最主要的危险因素[7]。与其他肿瘤一样，喉癌是由上述多种环境因素和遗传因素协同作用所致，是一种多基因参与、多阶段的复杂病理过程[8]。目前临床上主要采取手术和放化疗手段，但是大量资料证实，喉癌血行和淋巴结转移率占初诊患者的20%左右，在死亡患者中远处转移率更是高达65%以上[9]。因此如何预测患者预后，并选择合理的治疗方案具有重要的临床价值。目前许多血清肿瘤标志物检测广泛应用于喉癌的早期诊断及预后判断，近来研究发现血小板活化与肿瘤的转移复发密切相关[10]。

有研究发现，肿瘤细胞可通过释放炎性因子、基质金属蛋白酶等诱导血小板活化，而活化的血小板表面糖蛋白通过与肿瘤细胞结合形成血小板-肿瘤细胞复合物，从而为肿瘤细胞的脉管浸润及转移提供了病理条件[11]。PAC-1 是血小板膜表面表达最为丰富的糖蛋白分子，属于细胞表面粘附蛋白受体。血小板被激活后，PAC-1 的分子构型发生改变，从而介导活化血小板上GPⅡb/Ⅲa 与纤维蛋白原结合，是引起血小板聚集的关键因子[12]。CD62P 又称为血小板依赖性颗粒膜表面膜蛋白（PADGEM），同样也是粘附分子家族的成员之一，参与血小板的粘附和聚集过程，其分子结构为高度糖基化的单链跨膜蛋白，主要由血小板和血管内皮细胞合成并储存于血小板的α 颗粒和内皮细胞的Weibel-Palade 小体内[13]。血小板活化后可迅速导致PAC-1 和CD62P表达升高，其配体多为寡糖基团，如sialyl lewis x,sialyl lewis a, PSGL-1 等；肿瘤细胞表面可大量表达s-lewis x, s-lewis a 等寡糖，因此PAC-1 和CD62P可介导肿瘤细胞与活化内皮细胞的粘附并促进肿瘤细胞穿越血管壁，从而参与肿瘤细胞的血行转移。Qi 等[14]学者证实，激活的血小板在CD62P 的介导下，可与结肠癌、小细胞肺癌的结合并聚集在肿瘤细胞周围，降低肿瘤细胞与细胞外基质的粘附能力，从而为肿瘤细胞的转移提供必不可少的条件。本研究也发现，喉癌患者的PAC-1、CD62P 阳性表达率明显高于健康人群。可能与升高的TNF-α 刺激血小板及内皮细胞活化，α 粒和Weibel-Palade 小体迅速与质膜融合，高表达PAC-1 和CD62P 有关。另外喉癌患者PAC-1 和CD62P 阳性表达率与患者肿瘤的T 分期、淋巴结转移（N 分期）、远处转移密切相关。T 分期和N 分期越高，PAC-1 和CD62P 阳性表达率越高，同样远处转移组患者PAC-1 和CD62P阳性表达率高于未发生转移组，这与其他相关肿瘤中报道的一致，表明喉癌患者体内存在血小板活化，可能与喉癌细胞可分泌大量细胞因子、炎症介质、基质金属蛋白酶等特殊物质从而促使血小板表面大量表达粘附因子有关。除此以外，Huang 等[15]还发现血小板GPⅡb/Ⅲa 受体拮抗剂精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽可通过抑制血小板-肿瘤细胞复合物的形成，从而抑制大鼠肺鳞状细胞癌株的转移。基于上述药理作用分析，我们进一步对比了复发患者和未复发患者PAC-1 和CD62P 阳性表达率的差异。结果也证实PAC-1 和CD62P 高表达与喉癌的复发、转移密切相关。

综上所述，PAC-1 和CD62P 阳性表达率与喉癌患者T 分期、淋巴结转移和远处转移密切相关，同时可作为喉癌局部复发、区域淋巴结转移、远处转移的预测指标。