CEMP1基因修饰骨质疏松大鼠BMSCs与β－TCP体外复合培养实验

江俊 吴玉铭 何梦娇 郑宝玉 许雄程 李艳芬 陈玉玲 骆凯*

1．福建医科大学附属口腔医院，福建福州350002

2．中国科学技术大学附属第一医院安徽省立医院，安徽合肥230000

3．福建医科大学口腔医学研究院，福建福州350002

4．温州医科大学附属口腔医院，浙江温州325027

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种骨代谢疾病，以骨结构异常、骨脆性增高和骨量减少为主要临床表现，易出现骨折，严重影响中老年人的生活质量。更年期妇女随着体内雌激素水平的下降，骨量迅速丢失，易出现绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis，PMO)［1］。研究显示［2－3］PMO 与牙周炎存在明显相关性，可加速牙周组织的破坏。如何实现PMO状态下的牙周组织再生是当前牙周病临床治疗所面临的众多挑战之一。近年来，组织工程技术与基因工程技术的联合应用为实现牙周组织的修复再生提供了新的思路。牙骨质蛋白1(cementum protein 1，CEMP1)作为牙骨质特异性蛋白之一，可促进非矿化细胞向成骨细胞分化，有望应用于牙周组织的再生［4］。因此，本研究拟通过构建人CEMP1基因重组慢病毒过表达载体，并转染PMO大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，使CEMP1在PMO大鼠BMSCs中稳定表达，同时将过表达CEMP1的BMSCs与β磷酸三钙(β－tricalcium phosphate，β－TCP)复合培养，观察细胞的生长情况，为后续利用CEMP1实现骨质疏松状态下的牙周组织再生奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:3月龄 SPF级Sprague－Dawley(SD)雌性大鼠，体重280～300 g，动物许可证号:SCXK(沪)2012－0002。按啮齿类动物标准饲养于南京军区福州总医院比较医学科，适应性喂养1周后开始实验。

1.1.2 主要试剂与仪器:DMEM低糖培养基、胎牛血清(Hyclone，美国);0.25%胰蛋白酶(Gibico BRL，美国);重组慢病毒 LV－CEMP1－EGFP(本实验室保存);抗坏血酸、β－磷酸甘油、地塞米松和茜素红(Sigma，美国);碱性磷酸酯酶显色试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);Prime ScriptTMRT Reagent Kit和 SYBR Primix Ex TaqTM试剂盒(Takara，日本);Trizol试剂盒(Invitrogen，美国);β－TCP(上海贝奥路生物材料有限公司);CEMP1多克隆抗体(Abcam公司);生物安全柜(力申科学仪器有限公司，上海);细胞培养箱(Heraeus，德国);iMARK 酶标仪(Bio－Rad，美国);实时荧光定量PCR仪(Roche LightCycler 480，德国);相差荧光显微镜(Olympus，日本);电泳装置(Bio－Rad，美国);扫描电镜 (FEI Nova Nano SEM230，美国)。

1.2 方法

1.2.1 PMO大鼠BMSCs的获取及体外培养:参照课题组前期方法［5］建立骨质疏松大鼠模型，模型建立成功后将大鼠经麻醉颈椎脱臼处死。无菌条件下取出大鼠双侧股骨和胫骨，剪去骨端两侧，采用细胞培养液反复冲洗骨髓腔，直到骨头发白为止。将获取的细胞悬液经1 000 r/min，离心5 min，弃上清，DMEM低糖培养液(含青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L，10%FBS)重悬，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中。第3天首次半量换液，之后按常规进行换液。待细胞密度达到80%～90%时进行消化传代，实验选择P3以内细胞进行。

1.2.2 PMO大鼠BMSCs体外成骨分化能力检测:PMO大鼠BMSCs以每孔1×105个接种于6孔板，以成骨诱导液(基础培养液中加入50 μg/mL维生素C、10 mmol/L β－磷酸甘油、10 nmol/L 地塞米松)进行培养，每3天换液。诱导7 d后收集细胞进行ALP染色，诱导21 d后进行矿化结节茜素红染色。

1.2.3 PMO大鼠BMSCs基因转染检测:将PMO大鼠BMSCs以1×104/cm2密度进行接种，待细胞生长至约70%融合时参照课题组前期方法［6］进行目的基因转染。实验分组如下:转染组(LV－CEMP1－EGFP)、空载体组 (LV－EGFP)和空白对照组(BC)。目的基因转染后通过倒置荧光显微镜对转染细胞进行观察，采用流式细胞仪检测细胞的转染效率，通过实时荧光定量PCR及免疫细胞化学染色检测CEMP1的表达情况。实时荧光定量PCR反应引物序列见表1。

表1 PCR反应引物序列及产物大小Table 1 Specific primers of PCR and product size

1.2.4 基因转染PMO大鼠BMSCs与β－TCP复合培养:β－TCP预湿后置于37℃培养箱中备用，将LV－CEMP1－EGFP转染的PMO大鼠 BMSCs消化后，调整细胞密度至1×107个/mL接种于β－TCP表面，每平方厘米接种50 μL。37°C培养箱中静置2 h后缓慢加入培养液，24 h后进行倒置荧光显微镜和扫描电镜观察。

2 结果

2.1 PMO大鼠BMSCs原代培养及成骨分化能力检测

BMSCs原代培养3 d时，镜下仍有较多的红细胞存在，也可见到少量梭形贴壁细胞。随着时间的延长，细胞呈集落样生长，形态表现为纺锤形或多角形。培养10 d左右，细胞即可达到80%～90%，可进行传代(图1a)。成骨诱导液培养7 d时细胞ALP染色呈棕黑色(图1b)，成骨诱导液培养21 d时即可观察到茜素红染色呈橘红色的矿化结节(图1c)。

图1PMO大鼠BMSCs体外培养及成骨分化检测(×100)a:原代培养的BMSCs;b:ALP染色;c:钙结节茜素红染色。Fig．1 Morphological observation and osteogenic differentiation of PMO rat BMSCs(×100)

2.2 CEMP1基因转染PMO大鼠BMSCs检测

PMO大鼠BMSCs经慢病毒转染24 h即可观察到绿色荧光，随着时间的增加，细胞荧光逐渐加强，细胞形态未出现明显的改变，BC组未见荧光表达(图2)。通过流式细胞仪检测发现，转染72 h后LV－CEMP1－EGFP组荧光表达率为86.9%，见图2e。

2.3 基因转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1基因表达检测

实时荧光定量PCR结果显示CEMP1基因转染PMO大鼠 BMSCs后，仅 LV－CEMP1－EGFP组有CEMP1基因的扩增曲线，而LV－EGFP组和BC组均未见该基因扩增曲线(图3)。

图2 LV－CEMP1－EGFP转染PMO大鼠BMSCs检测(×100)a＆b:LV－CEMP1－EGFP 组;c＆d:BC 组;e:LVCEMP1－EGFP组转染率。Fig．2 Detection of PMO rat BMSCs after LV－CEMP1－EGFP transfection(×100)

图3PMO大鼠BMSCs中CEMP1 mRNA的表达 a:GAPDH扩增曲线;b:LV－CEMP1－EGFP转染组目的基因扩增曲线;c:空载体LV－EGFP转染组;d:BC组。Fig．3 Detection of CEMP1mRNA expression by Real time PCR

2.4 基因转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白表达检测

Western Blot检测结果显示，LV－EGFP组和BC组均未见CEMP1蛋白表达，仅LV－CEMP1－EGFP组可检测到CEMP1蛋白的表达(图4)。免疫细胞化学染色结果显示，LV－CEMP1－EGFP组细胞可见明显棕色染色(图5a)，而LV－EGFP组和BC组细胞均未见明显着色(图5b～图5c)。

2.5 基因转染PMO大鼠BMSCs与β－TCP复合培养

转染LV－CEMP1－EGFP的 PMO大鼠 BMSCs与β－TCP复合培养24 h，倒置荧光显微镜下观察可见有绿色荧光的细胞附着于β－TCP的不同层面(图6a、图6b)，在扫描电镜下观察可见材料表面细胞充分伸展，状态较好(图6c)。

图4 转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白的表达1:BC组;2:空载体 LV－EGFP转染组;3:LV－CEMP1－EGFP转染组。Fig．4 Western Blot of CEMP1 protein expression in PMO rat BMSCs after gene transfection

图5 转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白免疫细胞化学染色(×100)a:LV－CEMP1－EGFP转染组;b:空载体LV－EGFP转染组;c:BC组。Fig．5 Immunohistochemical staining of CEMP1 protein expression in PMO rat BMSCs after gene transfection(×100)

图6 基因转染PMO大鼠BMSCs与β－TCP复合培养(×100)a＆b:LV－CEMP1－EGFP 转染细胞与 β－TCP复合培养倒置荧光显微镜观察;c:LV－CEMP1－EGFP转染细胞与β－TCP复合培养扫描电镜观察;d:β－TCP扫描电镜观察。Fig．6 Co－ culture of PMO rat BMSCs with β － TCP after gene transfection(×100)

3 讨论

BMSCs具有多向分化能力，且取材相对容易，常用于组织工程技术和基因治疗中，可实现牙周组织的修复再生［7－9］。但现有的研究［10］认为 PMO 患者的BMSCs更易于向脂肪细胞分化，成脂能力更高，而细胞的成骨分化能力相应的有所减弱。动物实验［11］也证实与假手术组相比，PMO大鼠BMSCs的增殖与迁移能力显著降低，细胞的凋亡活性增加。因此，如何提升PMO状态下BMSCs的成骨分化能力是学者们亟待解决的问题。

CEMP1是从成牙骨质细胞瘤中发现的一种牙骨质特异性蛋白［12］，可促进牙周膜细胞向成牙骨质表型分化，促进牙骨质的再生［13－15］。转染 CEMP1基因的人牙龈成纤维细胞的成骨及成牙骨质相关基因表达增高，碱性磷酸酶活性增强，矿化结节形成能力得到显著提升［16］。上述研究提示，CEMP1可提高细胞的成骨分化能力，有望应用于牙周组织再生研究。因此本研究利用慢病毒载体将CEMP1转染至PMO大鼠BMSCs，结果显示转染细胞高表达CEMP1，这为后续探讨CEMP1基因修饰PMO大鼠BMSCs实现牙周组织再生研究创造了条件。

β－TCP属于人工合成材料，可作为组织工程支架材料构建工程化复合物，实现骨组织再生［17］。研究［18］发现将重组人骨形成蛋白－2复合于β－TCP后植入兔肌肉内8周，即可观察到明显的新生骨样组织。课题组以往研究［19］成功将犬颌骨骨膜细胞与β－TCP复合培养构建组织工程复合物，实现犬的牙周组织再生。因此，本研究选择多孔β－TCP作为种子细胞的支架材料。研究结果显示CEMP1基因修饰的PMO大鼠BMSCs在β－TCP上生长良好，形态正常，细胞间连接紧密，提示β－TCP对细胞的生长没有影响，生物相容性较好。

牙周炎与OP同为中老年人的常见病、多发病。如何实现OP患者牙周组织的再生是当前牙周临床医生所关注的重点。基因工程技术和组织工程技术的联合应用使理想的牙周组织再生成为可能。本实验首次以OP状态的BMSC为靶细胞转染CEMP1并与β－TCP复合，构建CEMP1修改的工程化复合物。结果显示，PMO大鼠BMSCs转染LV－CEMP1－EGFP后能稳定高效表达CEMP1，且在β－TCP表面及内部附着并生长良好，分泌胞外基质。表明在本实验条件下可成功构建以 β－TCP为支架的CEMP1基因修饰的工程化复合物，但该复合物的体内成骨能力及能否实现OP状态下牙周组织再生仍需后续进一步的研究探讨。