维生素K2对去卵巢大鼠股骨干骨折愈合影响的实验研究

吴信举 陶周善 陆汉力 万亮亮 丁国正 祁国庆 谢加兵 章荣

皖南医学院第一附属医院/弋矶山医院创伤骨科，安徽芜湖241000

在整个生命过程中，骨骼经历了一个连续的重塑过程，涉及骨吸收和骨形成。在骨骼生长期间和年轻成人期间，存在积极的骨平衡，即形成的骨骼多于被吸收的骨骼，然后达到平衡。但是在40岁之后，重吸收的骨组织比产生的多。这种现象可能会导致骨质疏松症状随着衰老而变得更加严重［1］。在绝经后的女性中，缺乏雌激素是损害骨质量的另一个因素，因此导致骨质疏松症，利于骨折的发生。治疗骨质疏松性骨折是一项挑战，因为老年患者更容易受到手术和麻醉并发症的影响。此外，骨质疏松骨不能为整形外科植入物提供良好的锚固［2］。骨折后的骨愈合是一个专门的修复过程，涉及一系列事件，包括炎症、成骨、愈伤组织形成和重塑［3］。最近已经证明卵巢切除动物(OVX)中雌激素受体表达的失调会损害骨愈合，这可以通过降低血管生成因子、减少骨形成标志物和增加骨吸收来证明，导致愈合延迟或不愈合。越来越多的证据［4］表明，维生素K2参与骨代谢，可能对骨质疏松症有益。维生素K2是骨钙素的一种羧化作用，骨钙素是一种含有c－羧基谷氨酸的骨基质蛋白，在骨代谢中起关键作用［5］。然而，膳食摄入维生素K2不足以支持骨钙蛋白和基质GLA蛋白的完全羧化。重要的是，据报道补充维生素K2会增加c－羧化骨钙素的水平并抑制骨质流失［6］。维生素K2在骨代谢中的重要性进一步得到体外研究的支持，该研究表明维生素K2对成骨细胞骨形成具有刺激作用，同时对破骨细胞骨吸收具有抑制作用［7］。因此，补充维生素K2可能具有作为骨质疏松症治疗方法的功效。然而，骨折后给予抗骨质疏松症治疗会刺激骨形成和骨折修复。因此，接受维生素K2可能对骨折愈合产生有益效果，本研究将评估维生素K2对切除卵巢大鼠骨折愈合的影响。

1 材料和方法

1.1 动物和造型方法

30只6月龄Sprague－Dawley(SD)雌性大鼠获自皖南医学院弋矶山医院。将大鼠圈养在温度受控的室内(25℃)，恒定湿度(40%～50%)并可以自由接近食物和水。将大鼠放置1周以适应环境，经历12 h/12 h光/暗循环。大鼠被随机分为假手术组(SHAM)、去卵巢组(OVX)、OVX+维生素 K2组，每组10只大鼠。首先以3 mL/kg的剂量在腹膜内注射10%水合氯醛，对20只雌性大鼠通过背部切口进行双侧卵巢切除术，切开大约1.5 cm的皮肤、腹腔和肌肉并暴露卵巢。将输卵管用丝线结扎并进行双侧卵巢切除术，其余10只动物进行假手术，检查双侧卵巢并在相同方案下恢复到原来位置。大鼠卵巢切除术后3个月，在麻醉状态下将其右侧股骨制作成股骨干中段骨折，并用髓内钉固定(直径1 mm，长度 50 mm;Wego Medical Systems Co．，Ltd，威海，中国)。所有程序均经皖南医学院弋矶山医院动物研究伦理委员会批准。

1.2 治疗方法和标本收集

将15 mg固力康胶囊(四烯甲萘醌软胶囊，15 mg/粒，国药准字J20100149，富士胶囊株式会社芝川工厂)溶入5 mL的氯化钠。OVX+维生素K2组骨折术后每天给予固力康6 mg(kg·d)灌胃治疗，在右侧股骨干骨折髓内固定术后口服给药。SHAM组和OVX组口服等量的0.9%氯化钠。治疗后8周使用双能 X射线吸收测定仪(DSC－3000，Aloka，Tokyo，Japan)测量骨密度(mg/cm2)。通过颈椎脱位处死大鼠。处死后从下腔静脉抽血，加入抗凝剂中，以3 000 r/min的速度搅拌20 min，提取血浆。将提取的血浆储存在－70℃直至分析使用。

1.3 检测指标

药物治疗后8周采集X射线(800 mA，150 kV，R－500;GE Healthcare Bio－Sciences，Pittsburgh，PA，USA)观察骨折愈合情况;同时检测骨折区域骨强度，使用DL3000型通用机器EMIC对分离的右胫骨进行三点弯曲测试评估。通用机器以5 mm/min的加载速率装配2 000 N容量的测力传感器。在右胫骨骨干弯曲试验中，支架两点之间的距离标准化为三分之二的试样，并且施加的负荷距各端等距。使用以下结构－机械性能进行测试:弹性(mJ)，其被定义为样品在弹性相中允许的能量;最大载荷(N)和刚度(103N/m)，它被定义为表示结构刚度的载荷和变形之间的关系。作为骨形成标志的血清骨钙素(BGLAP)、碱性磷酸酶(ALP)，各自用ELISA试剂盒(R＆D Systems，Inc．，Minneapolis，MN，USA)测量，同时使用ELISA试剂盒(R＆D Systems，Inc)测量抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)和血液雌二醇水平。

1.4 统计学分析

数据均以均数±标准差表示，并使用SPSS 19.0版统计软件进行统计学分析。单因素方差分析用于评估各组之间的差异。P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

大鼠股骨的X射线显示OVX大鼠的不完全愈合，通过维生素K2治疗后得到明显改善。治疗后8周观察到维生素K2对骨痂组织形成、重塑和骨愈合的影响明显。OVX+维生素K2组在8周时观察到骨痂形成和骨折愈合良好，但是在OVX组中，形成较小的骨痂组织并且重建不完整，没有发现明显的骨愈合(图1)。

OVX大鼠的BGLAP和ALP水平增加，并通过维生素K2治疗后显著改善。口服治疗8周后，OVX组与SHAM组相比，BGLAP和ALP水平显著升高(P＜0.05)。与OVX组相比，OVX+维生素K2组BGLAP和ALP水平显著降低(P＜0.05，图2，图3 A)。

在OVX大鼠中观察到血液TRACP及雌二醇水平的变化，其在维生素K2处理后未被逆转。与SHAM组相比，OVX大鼠的血液雌二醇显著降低(P＜0.05)，而 TRACP水平显著升高(P＜0.05)。然而，与OVX组相比，OVX+维生素K2组血液雌二醇没有显著增加(P＞0.05，图3 A)，而TRACP水平显著降低(P＜0.05)。

与SHAM组相比，OVX组检测结果显示股骨骨折区域刚度、最大载荷和弹性显著降低(P＜0.05);而OVX+维生素K2组的刚度、最大载荷和弹性在治疗8周后较OVX组显著增加(P＜0.05，图4)。

图2 维生素K2治疗8周后对骨形成标志物血液骨钙蛋白(A)和碱性磷酸酶(B)的影响(与SHAM组相比，*P＜0.05;与OVX组相比，#P ＜0.05)Fig．2 Effects of 8 weeks of Vitamin K2 treatment on bone formation markers(A)blood osteocalcin and(B)alkaline phosphatase

图3 维生素K2治疗8周后对骨吸收标志物TRACP和血液雌二醇水平的影响(与SHAM组相比，*P＜0.05;与OVX组相比，#P＜0.05)Fig．3 Effects of 8 weeks of Vitamin K2 treatment on bone resorption marker TRACP and blood estradiol levels

图4 三点弯曲测试结果Fig．4 Results of the three－point bending test

3 讨论

骨质疏松症是相对于骨形成而骨吸收增加，导致正常骨重建紊乱、骨量低、骨折风险高［8］。据报道，仅在美国，骨质疏松症就影响了大约2 500万人，＞50岁的女性患髋部骨折的风险为大约为11%～18%［9］。因此，为了预防和治疗骨质疏松症，通常使用药物、运动和其他治疗方案如激素替代疗法。其中，激素替代疗法是最广泛使用的;然而，之前的证据表明，使用这些药物进行长期治疗可能会引起不良反应，例如卵巢癌和子宫内膜癌的风险增加［10］。因此，需要具有已证实功效和安全性的替代治疗策略。

据报道，维生素K2对骨骼具有合成代谢作用，这可能有助于其在诱导成骨细胞增殖和分化中的作用，从而产生骨形成。卵巢切除术模型是骨质疏松症研究中公认的动物模型［11］。OVX大鼠模型被选择用于本研究，因为它与绝经后骨丢失有许多相似之处，并且被美国食品和药品管理局推荐为评估骨质疏松症治疗的具有长期骨骼安全性和功效的测试物种。以前的实验室研究报道，骨质疏松症会影响早期和晚期的骨折愈合［12］。骨密度降低是危及骨强度的主要因素之一，导致骨折易感性增加［13］。本研究显示，OVX可降低雌性SD大鼠的股骨骨密度，而维生素K2治疗可预防骨密度降低。

BGLAP与骨中的羟基磷灰石和钙紧密结合，是一种确定的骨形成标志物，用于预测骨丢失率，因为它在骨生成过程中间接参与成骨细胞的活化［14］。ALP是一种水解酶，负责从许多类型的分子中去除磷酸基团，包括核苷酸、蛋白质和生物碱［15］。ALP在活跃的骨形成过程中增加，因为ALP是成骨细胞活性的副产物(其水平升高出现在佩吉特病中)［16］。TRACP是在哺乳动物中表达的糖基化单体金属蛋白酶，可以作为骨吸收标志物。作为骨基质磷蛋白的骨桥蛋白和骨涎蛋白是高效的体外TRACP底物，其在磷酸化时与破骨细胞结合。部分去磷酸化后，骨桥蛋白和骨涎蛋白不能与破骨细胞结合［17］。从这种效应来看，已经假设TRAP是从破骨细胞的皱褶膜中分泌出来的，它会使骨桥蛋白去磷酸化并使破骨细胞迁移并发生额外的再吸收［18］。OVX组显著增加了血液BGLAP、ALP和TRACP水平，而OVX+维生素K2组则显著改善了骨转换。

这些结果可能是由于雌激素减少所以增加了成骨细胞和破骨细胞的数量，或者这些细胞活性产生了改变。最常见的骨质疏松症是与卵巢激素缺乏相关的绝经后骨质流失［19］。以前的几项研究报告指出，雌激素是维持骨量最重要的激素，这种激素的缺乏是两性中与年龄相关骨丢失的主要原因［20］。值得注意的是，当循环的雌激素水平降低时，骨骼中的钙迅速减少，并且通过尿排泄的增加发生钙丢失［21］。在目前的研究中，使用ELISA试剂盒测量大鼠血液雌二醇水平。与SHAM组相比，经历卵巢切除术诱导的大鼠表现出血液雌二醇水平的显著降低。在本研究中，灌胃治疗8周的OVX+维生素K2组显示血液雌二醇与OVX组相比无显著增加，表明维生素K2并不是通过改善体内雌激素来促进骨形成。

本研究通过X射线检查，探讨了维生素K2治疗8周后对愈伤组织形成、重塑和骨愈合的影响。SHAM组每2周愈伤组织形成和骨愈合增加，假手术后8周骨折线模糊。在OVX组中，形成了小的愈伤组织并且骨折线明显，表明没有愈合。经过维生素K2给药后，骨痂组织形成和骨愈合明显加速，骨折线几乎不存在，并且8周后观察到骨愈合和重塑。

综上，本研究表明，维生素K2可减轻骨量减少大鼠骨密度的降低，在骨折后给药可加速矿化和骨生成，并能改善骨折愈合。维生素K2有望成为绝经后骨质疏松症骨折愈合的辅助治疗方案，但是其发挥这些作用的机制仍有待研究。