99Tc－MDP通过miR－338－3p靶向下调 RANKL抑制破骨细胞活性机制研究

朱丽璇 崔玥 罗静

云南省第一人民医院疼痛科，云南昆明650032

骨质疏松症是一种代谢性骨病，其特征在于骨量和密度的降低，主要致病原因是骨生成和骨吸收之间的动态平衡被破坏［1－2］，因此骨质疏松症患者发生脆性骨折的几率会大大增加［3－4］，尤其是绝经后妇女［5－6］。目前国内采用锝［99Tc］亚甲基二膦酸盐(99Tc－MDP)来治疗骨质疏松症，它是我国自主研发治疗类风湿关节炎等疾病的一种药物，可抑制人破骨细胞生成并通过改善松质骨和皮质骨以及增加外在骨硬度来发挥抗骨质疏松作用［7－8］。有研究［9］报道，miR－338－3p调节小鼠骨髓基质干细胞的成骨分化;miR－338－3p通过靶向核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor－κB ligand，RANKL)抑制糖皮质激素诱导的骨质疏松［10］。而RANKL不仅可以诱导破骨细胞分化，而且在骨质疏松患者中高表达［11］。但是，99Tc－MDP通过miR－338－3p靶向RANKL缓解骨质疏松尚未有研究报道。因此，本研究旨在探究其中可能存在的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

在手术中抽取本院收治的骨质疏松患者股骨上端液态的红骨髓，用D－Hanker’s液等倍稀释，离心获得骨髓单个核细胞，用25－(OH)2D3诱导成破骨细胞(osteoporosis－derived osteoclast，OC);99Tc－MDP购于成都云克药业有限责任公司;TRIZOL以及蛋白提取试剂盒购于赛默飞公司;反转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒购于Takara公司;免疫印迹一抗(GAPDH和RANKL鼠抗)和二抗(羊抗鼠)购于CST公司;SDS－PAGE凝胶制备试剂盒购于贝博生物;DMEM、胎牛血清以及青链霉素购于Gibco公司;CCK－8试剂盒购于碧云天生物科技有限公司;miR－338－3p mimics/inhibitor以及 sh－RANKL 购于百奥迈科生物技术有限公司;Lipofectamine 2000转染试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染:OC细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素、1×10－7mol/L地塞米松和 1×10－8mol/L 25－(OH)2D3的 DMEM 培养基中，并置于条件为37℃、5%CO2细胞培养箱中培养1～3周。接种适量细胞于24孔板中，当细胞密度达到50%～60%时进行细胞转染。严格按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书操作破骨细胞转染，对照组转染空载体，过表达组将 miR－338－3p mimics转染到破骨细胞中。转染细胞在37℃、5%CO2培养箱中继续培养，6～8 h后换液，并加入完全培养基。培养72 h后检测转染效率，实验重复3次。

1.2.299Tc－MDP制备:按照试剂商提供的操作手册将试剂A(共有5 mL，含0.05 g99Tc)和试剂B(含5 mg MDP以及0.5 mg氯化亚锡)室温混合5 min，最后调整原液浓度为1 μg/mL MDP。

1.2.3 qRT－PCR 检测 miR－338－3p、CD51、以及MMP－9表达:收集对数期转染的细胞，用TRIZOL法进行总RNA提取，并用Nanodrop定性以及定量。按照反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，反应条件为37℃，15 min;85℃，5 s。随后按照荧光定量PCR试剂盒说明检测miR－338－3p以及CD51和MMP－9 mRNA表达，以GAPDH或U6作为参照，引物由擎科生物合成，序列如表1所示。数据由2－ΔΔCt方法处理，实验重复3次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 CCK－8检测OC细胞增殖:收集对数期OC细胞，接种至96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，37℃、5%CO2预培养24 h。次日，向每孔加入10 μL CCK－8 溶液，培养箱孵育 2 h。随后每 0、24、48、72、96 h检测细胞在450 nm处吸光值，实验重复3次。

1.2.5 Western blotting检测RANKL表达:严格按照蛋白提取试剂盒说明提取细胞总蛋白，BCA定量。取等量蛋白加入上样缓冲液95℃加入10 min。随后用10%SDS－PAGE分离蛋白，并转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。去除脱脂奶粉，TBST清洗 3次，加入稀释的一抗(RANKL，1∶1 000)4℃摇床孵育过夜。回收一抗，用TBST清洗PVDF膜3次，加入二抗，室温摇床孵育2 h。最后回收二抗，TBST清洗3次，加入化学发光显色液，凝胶成像显影，分析条带灰度值。实验重复3次。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测miR－338－3p与RANKL靶向关系:通过TargetScan以及starBase数据库查到miR－338－3p与RANKL结合的位点，用PCR扩增后连接到质粒中，构建野生型质粒。突变其结合位点，得到突变型质粒。将 miR－338－3p mimics与质粒共转染到293T细胞中，随后按照双荧光素酶报告基因试剂盒说明书检测荧光强度。实验重复3次。

1.3 统计学方法

通过SPSS 20.0统计软件分析实验数据，相关实验图片的绘制采用Graphpad软件绘制。

组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01表示数据差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 99Tc－MDP抑制OC细胞活性

qRT－PCR结果表明，99Tc－MDP能够显著下调OC细胞中破骨细胞活性标志物CD51和MMP－9的表达水平，且呈剂量依赖性(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001，图 1 A);CCK－8结果表明，随着99Tc－MDP浓度增加，OC细胞存活率逐渐降低，半抑制浓度(IC50)为 14 ng/mL(图 1B)。因此，99Tc－MDP 可以抑制OC细胞活性以及CD51和MMP－9的分泌。

图1 99Tc－MDP抑制OC细胞活性及CD51和MMP－9的分泌 A:qRT－PCR检测OC细胞中CD51和MMP－9 mRNA的表达水平;B:CCK－8实验检测OC细胞存活率。Fig．1 99Tc－MDP inhibited the cell activity and the expression of CD51 and MMP－9 of OC cells

2.2 99Tc－MDP促进 miR－338－3p表达并抑制RANKL表达

分别在细胞培养基中加入0、5、14 ng/mL的99Tc－MDP，常规培养。qRT－PCR 结果表明，随着99Tc－MDP浓度的增加，miR－338－3p表达水平显著上升(P＜0.05或 P＜0.01，图 2 A);Western blotting结果表明，RANKL表达随着99Tc－MDP浓度升高显著下调(P＜0.05或 P＜0.01，图2B)。以上结果说明，99Tc－MDP 可以上调 miR－338－3p，下调 RANKL的表达水平。

图2 99Tc－MDP促进miR－338－3p表达且抑制RANKL表达 A:qRT－PCR检测OC细胞中miR－338－3p的表达水平;B:Western blotting检测OC细胞中RANKL的表达水平。Fig．2 99Tc－MDP promoted the expression of miR－338－3p and suppressed the expression of RANKL

2.3 miR－338－3p靶向下调RANKL

通过TargetScan和starBase数据库分析得知，RANKL是miR－338－3p潜在下游靶点，结合位点如图3 A所示。双荧光素酶报告基因结果表明，与对照组相比，共转 miR－338－3p mimics+RANKL－WT显著降低荧光素酶活性(P＜0.01，图3B);而共转miR－338－3p mimics+RANKL－MUT 时荧光素酶活性与对照组无明显差异。Western blotting结果表明，与对照组相比，过表达miR－338－3p可以显著下调 RANKL 表达(P＜0.05，图 3C)。因此，miR－338－3p可以靶向结合RANKL并下调其表达。

2.4 99Tc－MDP通过 miR－338－3p靶向下调RANKL抑制OC细胞增殖及活性

图3 miR－338－3p靶向下调RANKL A:Targetscan生信网站预测miR－338－3p与RANKL的结合位点;B:双荧光素酶报告基因系统验证miR－338－3p与RANKL的靶向关系;C:Western blotting检测OC细胞中RANKL的表达水平。Fig．3 miR－338－3p targeted RANKL and suppressed its expression

qRT－PCR结果表明，与对照组相比，培养基加入14 ng/mL99Tc－MDP 显著上调 miR－338－3p;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor组 miR－338－3p表达显著低于99Tc－MDP 组;而99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor组 miR－338－3p表达显著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 组(P＜0.01，图 4 A)。Western blotting结果表明，99Tc－MDP 组RANKL表达显著低于对照组;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor组 RANKL表达显著高于99Tc－MDP组;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 组RANKL表达显著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor组(P＜0.01，图 4B)。CCK－8结果表明，与对照组相比，加入14 ng/mL99Tc－MDP后，OC细胞增殖活力显著降低;而99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor组OC细胞增殖活力显著高于99Tc－MDP组;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 组OC细胞增殖活力显著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor组(P＜0.01，图 4C)。qRT－PCR 结果表明，OC细胞活性标志物CD51以及MMP－9表达方面，99Tc－MDP 组显著低于对照组;99Tc－MDP+miR－145 inhibitor组显著高于99Tc－MDP 组;99Tc－MDP+miR－145 inhibitor+sh－MKK4 组显著低于99Tc－MDP+miR－145 inhibitor组(P＜0.01，图 4D)。因此，99Tc－MDP通过miR－338－3p靶向下调RANKL抑制OC细胞增殖及活性。

3 讨论

骨质疏松症是一种常见疾病，其特征是低骨密度和低创伤性骨折，主要是由于成骨细胞的骨形成超过破骨细胞的骨吸收所致［12－13］。骨质疏松症是全球主要的公共卫生问题之一，特别是在人口老龄化较多的国家，如中国［14］。99Tc－MDP 是中国自主研发的抗炎药物，自1997年以来，它已被用于中国类风湿关节炎和强直性脊柱炎的安全治疗［15］。已有文献报道，99Tc－MDP可用于治疗骨质疏松，但具体作用机制尚不完全明确。

microRNA是一种长度仅有20～24 bp的非编码RNA［16］。目前发现有 miRNAs可能与骨质疏松症相关，有文献报道miR－422a可能是骨质疏松症的潜在生物标志物［17］;miRNA－133a通过促进破骨细胞分化参与绝经后骨质疏松症的调节［18］。本研究发现，miR－338－3p在 OC细胞中低表达，并且随着99Tc－MDP浓度的增加，miR－338－3p表达也显著增加。此外，在99Tc－MDP作用下，过表达miR－338－3p显著抑制OC细胞存活，且破骨细胞活性标志物CD51以及MMP－9表达显著下调。

MiRNA一般都是通过调控下游蛋白以参与疾病的发生发展。RANKL是肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族的成员，由成骨细胞、成纤维细胞和活化的T细胞及B细胞表达［19］，并且RANKL可以诱导破骨细胞形成以及影响其功能［20］。此外，RANKL在破骨细胞前体细胞表面与RANK结合，导致破骨细胞前体细胞的分化和融合，并刺激成熟破骨细胞的活性［21］。有研究报道，在破骨细胞中miRNA能够调控RANKL表达。例如，miR－302a－3p调节人下颌骨成骨细胞样细胞中的 RANKL表达［22］;25－hydroxycholesterol通过在miR－139－5p的转录中协调NFATc1和Sp1复合物来促进RANKL诱导的破骨细胞生成［23］。在骨质疏松中，miR－338－3p通过靶向RANKL抑制糖皮质激素诱导的破骨细胞生成［10］。本研究通过实验发现，miR－338－3p靶向下调RANKL，并且敲降RANKL可以抑制OC细胞增殖以及活性标志物CD51以及MMP－9表达。进一步研究表明，99Tc－MDP通过miR－338－3p靶向下调RANKL抑制OC细胞增殖及活性从而缓解骨质疏松发生。

综上所述，本研究初步探讨了99Tc－MDP通过miR－338－3p靶向下调RANKL抑制破骨细胞活性进而缓解骨质疏松发生可能的分子机制，为后期更深入的探究骨质疏松治疗方法提供了新的治疗靶点和策略。

图4 99Tc－MDP通过miR－338－3p靶向下调RANKL抑制OC细胞增殖及活性 A＆D:qRT－PCR检测OC细胞中miR－338－3p、CD51和MMP－9 mRNA的表达水平;B:Western blotting检测OC细胞中RANKL的表达水平;C:CCK－8实验检测OC细胞增殖活力。Fig．4 99Tc－MDP inhibited the proliferation and cell activity of OC cells through miR－338－3p targeting and downregulating RANKL