氨氮胁迫对凡纳滨对虾肠道免疫相关指标的影响

熊大林，段亚飞，王 芸，张家松，陈成勋，董宏标，李 华，刘青松

（1.天津农学院水产学院，天津 300384；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东省渔业生态环境重点实验室，广州 510300）

凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）又称南美白对虾，是我国重要的海水养殖虾类［1］。然而，在对虾集约化养殖模式中，养殖密度过高导致环境胁迫增加、病害频发，对虾死亡率居高不下。养殖病害是病原、环境和动物之间互作的结果，其中环境胁迫是主要的诱导因素［2］。氨氮是对虾养殖中主要的环境胁迫因子，其主要是由对虾残饵、排泄物等含氮有机物分解产生［3］。研究表明，高浓度的氨氮胁迫会造成对虾抗病力降低、免疫力下降和病原易感性增加等，危害对虾的存活和生长［4-6］。

近年来，对虾肠道炎症问题广受关注。肠道是对虾营养和免疫的主要器官组织，其作为动物消化道的主要屏障，能够分隔肠腔内物质，阻止病原微生物入侵机体［7］。此外，对虾肠道内栖息着大量的微生物菌群尤其是病原微生物，其同样富含于对虾养殖水环境中［8］。因此，对虾肠道组织受到内外环境的双重影响，极易遭受环境胁迫而导致黏膜组织损伤和免疫功能紊乱，增加病原入侵机体的风险［9-10］。然而，作为对虾高密度养殖条件下主要的水质胁迫因子——氨氮，其对养殖对虾肠道免疫功能影响的研究尚未见报道。

对虾缺乏获得性免疫系统，主要依靠非特异性免疫因子抵抗病原感染和环境胁迫。酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）是动物体内参与免疫防御的重要水解酶［11］。溶菌酶（Lys）和酚氧化酶原（proPO）可作为衡量对虾抗病原感染的功能指标［11-12］。抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）和热休克蛋白（HSPs）具有清除生物体内活性氧自由基、保护细胞免受氧化损伤的功能［9］。因此，本研究通过测定急性氨氮胁迫下凡纳滨对虾肠道这几种免疫生化指标和基因表达量变化，旨在探讨对虾肠道组织应答氨氮胁迫的免疫学特征，筛选其相关评价指标，以期为其肠道健康研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用健康凡纳滨对虾取自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，平均体质量（5.4±0.3）g；于500 L玻璃纤维桶中暂养7 d，每桶50尾。实验期间，水温30℃，盐度30，pH 8.3，不间断充气，每天换水1/3，并投喂对虾配合饲料。

1.2 氨氮胁迫实验

将暂养7 d的对虾随机分为两组，即：对照组和氨氮胁迫组，每组3个平行，每个平行50尾虾。氨氮胁迫组的水体氨氮含量设定为20 mg·L-1，使用10 g·L-1的NH4Cl进行调节；每4 h使用靛酚蓝分光光度法（GB 17378.4-2007）检测水中氨氮浓度，并用NH4Cl溶液进行调整；每天换水1/3，并加入相应氨氮浓度的养殖海水。对照组实验和暂养期间的养殖条件一致。分别于胁迫后的0、6、12、24、48和72 h，取对虾中肠于液氮中冷冻保存。同一时间点每个平行组分别取6尾虾的中肠，用镊子轻轻刮去肠道内容物，分别使用3尾用于生化指标和基因表达分析。

1.3 生化指标测定

使用预冷的0.86%生理盐水对所取的肠道组织进行漂洗，去除组织液，滤纸拭干，称重后置于离心管中。按照m（组织，g）∶V（生理盐水，mL）=1∶9加入预冷的0.86%生理盐水，超声粉碎制备组织匀浆液；然后于4℃、3 000 r·min-1离心10 min，取上清液于-80℃保存，用于生化指标测定。

使用南京建成生物工程研究所试剂盒分别测定 ACP、ALP、Lys、T-AOC和 SOD活性，以及组织蛋白含量，相关操作按试剂盒说明书进行。各项指标测定所用试剂盒均为同批次试剂。总蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。ACP活性测定采用磷酸苯二钠法，以1 g组织蛋白与基质作用30 min产生1 mg酚为1个活力单位；ALP活性测定采用磷酸苯二钠法，以1 g组织蛋白与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位；Lys活性测定采用比浊法；1 mg组织蛋白与基质作用1 min使反应体系的吸光度（OD）值增加0.01为1个T-AOC单位；SOD活性采用羟胺法，以1 mg组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的 SOD量为1个酶活力单位（U·mg-1）。

1.4 免疫基因表达分析

使用Trizol试剂提取氨氮胁迫后各时间点对虾肠道组织的总 RNA；使用核酸定量仪（ThermoFisher，USA）检测其纯度和浓度，使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量及完整性。使用DNaseⅠ去除总RNA中多余的DNA，使用MMLV反转录酶将RNA反转录为cDNA，保存于-20℃下备用，具体操作按照说明书进行。

根据NCBI数据库中的凡纳滨对虾热休克蛋白70（HSP70）、热休克蛋白 90（HSP90）、酚氧化酶原（proPO）基因和内参基因β-actin的cDNA序列，使用Primer premier 5.0软件分别设计正反特异性引物（表1），利用Real-time PCR对各组上述几种基因的表达量进行检测，每个样品3个平行，按照 SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TaKaRa，Beijing）试剂盒说明书进行。反应体系为20μL，包括10μL SYBR Premix ExTaqTMⅡ （2×），0.8 μL 10μmol·L-1正向引物，0.8μL 10μmol·L-1反向引物，0.4μL ROX Reference DyeⅡ （50×），2.0μL cDNA，6.0μL DEPC水。反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。采用 2-ΔΔCT法计算各基因的相对表达量。

1.5 数据分析

所得实验数据均以平均值±标准差表示，用SPSS17.0进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 氨氮胁迫对凡纳滨对虾肠道免疫酶活性的影响

与对照组相比，氨氮胁迫6 h，对虾肠道ACP活性显著升高（P＜0.05）；随后逐渐降低，并于24～72 h显著低于对照组（P＜0.05）（图1-A）。ALP活性于氨氮胁迫6 h显著升高（P＜0.05），并于12 h达到最大值；随后于48 h和72 h逐渐降低至显著低于对照组（P＜0.05）（图1-B）。Lys活性于氨氮胁迫6 h显著升高（P＜0.05），随后逐渐升高，并于24 h达到最大值；氨氮胁迫72 h，Lys活性显著低于对照组（P＜0.05）（图1-C）。

表1 本研究所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

2.2 氨氮胁迫对凡纳滨对虾肠道抗氧化酶活性的影响

与对照组相比，对虾肠道T-AOC活性于氨氮胁迫6 h显著升高（P＜0.05），并于12 h达到最大值；随后于48 h和72 h显著降低（P＜0.05），并低于对照组水平（图2-A）。SOD活性于氨氮胁迫6 h显著升高至最大值（P＜0.05），随后逐渐降低，并于48 h和72 h显著低于对照组（P＜0.05）（图2-B）。

2.3 氨氮胁迫对凡纳滨对虾肠道免疫基因表达的影响

与对照组相比，氨氮胁迫 6 h，对虾肠道HSP70基因表达水平显著升高（P＜0.05），并于24 h达到最大值；随后表达水平虽有降低，但仍显著高于对照组（P＜0.05）（图3-A）。HSP90基因表达水平于氨氮胁迫后12 h显著升高至最大值（P＜0.05），随后逐渐降低，并于48 h和72 h达到对照组水平（图3-B）。proPO基因表达水平于氨氮胁迫6 h显著升高（P＜0.05），并于12 h达到最大值；随后表达水平逐渐降低，并于72 h达到对照组水平（图3-C）。

图1 氨氮胁迫对凡纳滨对虾肠道免疫酶活性的影响Fig.1 Immune enzyme activities in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

图2 氨氮胁迫对凡纳滨对虾肠道抗氧化酶活性的影响Fig.2 Antioxidant enzyme activities in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

图3 氨氮胁迫对凡纳滨对虾肠道免疫基因表达的影响Fig.3 Immune gene expression in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

3 讨论

对虾主要依赖其非特异性免疫系统来抵御环境胁迫。研究表明，环境胁迫能够损伤对虾肠道黏膜组织，破坏肠道菌群的稳定性，给条件致病菌创造入侵宿主机体的机会［9-10，12-13］。例如，凡纳滨对虾分别被氨氮和亚硝酸盐胁迫72 h，肠道黏膜上皮细胞受损、脱落，黏液蛋白基因表达量紊乱，菌群多样性降低、条件致病菌丰度增加［13］。此外，硫化物、脂多糖也会导致凡纳滨对虾肠道屏障功能受损［9-10，12］。因此，研究环境胁迫下对虾肠道抗病原感染、抗氧化等免疫功能指标变化，可以为其肠道损伤保护研究提供理论参考。

ACP和ALP是两种重要的溶酶体酶，属于磷酸单酯水解酶类，其活性常用作虾类非特异免疫功能的评价指标［14］。Lys作为对虾机体中重要的抗菌蛋白，可以裂解细菌细胞，是吞噬细胞杀菌的物质基础［15］。proPO系统可以识别革兰氏阴性菌的脂多糖、真菌的β-1，3-葡聚糖和革兰氏阳性菌的肽聚糖等，是虾类机体识别“非己”成分的免疫系统［16-17］。艾春香等［18］研究表明，氨氮胁迫导致拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）鳃和肝胰腺中ACP和AKP活性显著下降。岳峰等［19］研究表明，氨氮胁迫导致三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血细胞proPO活性和溶菌活力显著下降。本研究中，凡纳滨对虾被氨氮胁迫6 h和12 h，肠道ACP、ALP和Lys活性以及proPO基因表达水平显著升高（P＜0.05），表明机体合成大量抗菌蛋白用于应对氨氮胁迫的毒性作用；但是，氨氮胁迫72 h，ACP、ALP和 Lys活性显著下降，表明氨氮胁迫对对虾非特异性免疫功能造成了损伤，降低了其抗病原感染能力。

当动物遭受环境胁迫时，机体会产生过量的活性氧（ROS），导致氧化损伤［20］。为维持机体细胞稳态，虾类体内形成抗氧化防御系统包括抗氧化酶系统和非酶促系统，而其功能状况可以用T-AOC来衡量［11］。SOD在机体清除超氧阴离子（·O2-）过程中首先被诱导，可将·O2-分解为H2O2和 O2，是抗氧化酶系统的标志酶［9］。王芸等［4］研究表明，中 国 明对虾 （Fenneropenaeus chinensis）被 8 mg·L-1氨氮胁迫后6 h，其血淋巴中T-AOC活性显著升高，随后逐渐降低。任海等［21］研究表明，在不同浓度氨氮胁迫下，脊尾白虾（Exopalaemoncarinicauda）血淋巴和肝胰腺中SOD活性随氨氮浓度的增加和胁迫时间的延长，呈先上升后下降的趋势。本研究中，氨氮胁迫6 h，凡纳滨对虾肠道T-AOC活性显著升高（P＜0.05），且SOD活性达到最大值，表明对虾肠道抗氧化酶系统被激活用于清除机体集聚的ROS；但是氨氮胁迫48 h和72 h，T-AOC和SOD活性均显著降低，表明氨氮胁迫诱导机体产生了过量ROS，超过了抗氧化酶的调节阈值，导致抗氧化酶系统受损。

热休克蛋白如HSP70和HSP90等，是生物体内主要的应激蛋白，其主要以“分子伴侣”形式修复机体受损的组织蛋白，在细胞保护、抗氧化等方面具有很重要作用［22］。HSPs表达量增加可以用于机体抵抗环境胁迫，提高动物的抗应激能力［23］。研究表明，机体HSP70与SOD基因的表达水平相一致，且HSP70直接增加机体内源性过氧化物酶活性，用于降解 ROS［24］。王芸等［25］研究表明，中国对虾在氨氮胁迫下6～24 h，其机体HSP90基因表达量显著上调，随后下降。本研究中，凡纳滨对虾肠道HSP70基因表达水平在氨氮胁迫72 h内均显著高于对照组（P＜0.05），表明HSP70在对虾肠道组织抵御氨氮胁迫进程中发挥重要作用。而HSP90基因在氨氮胁迫6～12 h显著升高（P＜0.05），随后逐渐降至对照组水平，其与中国对虾的研究结果相似，表明长时间的氨氮胁迫造成肠道免疫功能受到抑制，从而导致HSP90基因表达水平下降。

4 小结

20 mg·L-1氨氮急性胁迫凡纳滨对虾72 h，对虾肠道抗病原感染指标（ACP、ALP、Lys和proPO），以及抗氧化功能指标（T-AOC、SOD、HSP70、HSP90）发生显著变化，表明氨氮胁迫造成对虾肠道免疫功能紊乱。本研究所选的几种免疫指标对氨氮胁迫的反应均较为敏感，可以作为对虾肠道免疫损伤保护研究的评价指标。