凤鲚染色体核型研究

蒋 俊，庄 平，宋 超，赵 峰，3，周丽青，耿 智，郝长杰，张 涛

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；3.农业农村部东海与长江口渔业资源环境科学观测实验站，上海 200090；4.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071）

凤鲚（Coiliamystus）俗称凤尾鱼、烤籽鱼、籽鲚 等，属 鲱 形 目 （Clupeiformes），鳀 科（Engraulidea），鲚属，分布于西太平洋的中国、朝鲜半岛和日本海域，我国渤海、黄海、东海、南海和台湾海域均有分布［1-2］。凤鲚为半溯河洄游性鱼类，栖息于沿岸浅水区或近海，繁殖期集群洄游至河口咸淡水区域产卵［1］。长江口是凤鲚重要的产卵场，历史上凤鲚曾是长江口“五大渔汛”之一，历史最高年产量达3 252 t，占长江口渔业总产量50%左右。然而由于水体污染、生境破坏、过度捕捞等原因，长江口凤鲚资源急剧衰退［3］。2009—2011年年均捕捞量仅 100 t左右［3］。目前，已基本不能形成渔汛，资源岌岌可危。

近年来，对凤鲚的研究多集中在凤鲚资源［4］、分类［5-6］及繁殖生物学［7-8］等方面，而对其遗传学方面研究较少［9］。作为生物遗传物质信息的主要载体，染色体是生物进化的档案库［10］。现有的资料表明，在鱼类的种质资源、分类进化、性别决定等方面的研究中，对鱼类染色体的核型进行分析具有重要的实际意义，通过核型分析研究方法所得的结论在鱼类遗传育种方面也是重要的参考资料［11-12］。关于凤鲚染色体的核型分析迄今尚未见报道，因此，本研究通过对凤鲚染色体制作和核型分析来补充凤鲚的细胞遗传学数据，以期为凤鲚种质资源保护、遗传育种和分类学提供理论基础和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用凤鲚采自上海临港近岸海域，为1～2龄的性成熟个体，用于染色体核型分析的10尾（♀5，♂5）凤鲚，体质量分别为（7.52±1.41）g（♀）和（3.70±0.60）g（♂），体长分别为（121.40±7.70）cm（♀）和（101.00±4.36）cm（♂）。样品采集后放入泡沫箱中暂养20 min，待鱼体稳定后进行实验，暂养水温控制在24℃。

1.2 染色体标本的制作

参照林义浩［13］和舒虎等［14］的方法，对染色体标本制备方法进行了改进，方法如下：

1）秋水仙素前处理：采样现场取凤鲚鳃丝，放入0.04%秋水仙素溶液（50%过滤当地海水+50%去离子水）中处理30～45 min。

2）低渗：移除秋水仙素残液，将鳃丝样品放入10 mL离心管中，加入0.05 mol·L-1KCl低渗处理50 min。低渗过程中轻轻上下颠倒离心管数次，使组织细胞低渗充分。

3）固定：移除低渗液，加入提前预冷的Carney′s固定液（V甲醇∶V冰醋酸 =3∶1）冰浴固定，每15 min更换一次固定液，重复3次。

4）解离：将固定后的样品放入已预冷的解离液（V冰醋酸∶V蒸馏水=1∶1）中，将鳃丝剪碎，用预冷的一次性吸管吹散鳃丝上的细胞，用手指轻弹管壁或将离心管上下颠倒数次，形成样品的细胞悬浮液，最后放入4℃冰箱预冷。

5）热滴片：用预冷的一次性滴管吸取预冷的解离样品细胞悬浮液，从离受热板1～1.5 m高度的台面选定3个刻度（相隔2 cm）垂直滴片，滴片后立即平移至受热板的边缘，迅速用滤纸吸干，利用受热板的余温将细胞或者染色体贴附，使冰醋酸和蒸馏水挥发。

6）染色：滴片干燥后，采用10%吉姆萨染液染色30 min，蒸馏水冲洗5～10 s，自然干燥后镜检。

1.3 核型计数及分析

OLYMPUSBX51显微镜下对不同雌雄个体的染色体中期分裂相进行拍照，平均选取每尾鱼12个，共120个分布良好且清晰的分裂相，用Image-Pro Plus 6.0软件对染色体进行计数。雌雄各选10个具有代表性（分布效果良好、数目清晰完整、长度适中、着丝点清楚）的中期分裂相进行染色体配对和长度测量，根据LEVAN［15］的标准对染色体进行配对、分类、组型排列，计算染色体相对长度（实测单条长度×2/全部染色体长度总和×100%）。采用T检验方法，利用SPSS 24软件对雌雄凤鲚间及其彼此相邻的染色体相对长度差异性进行显著性检验（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1 凤鲚二倍体染色体数目

在显微镜下，对10尾凤鲚（♂5，♀5）中平均每尾鱼12个中期分裂相染色体（2n），共120个中期分裂相（2n）进行计数、统计（表1）。结果表明，雄性凤鲚染色体数目为48条，占所测60个雄性中期分裂相的71.7%，雌性凤鲚染色体数目为47条，占所测60个雌性中期分裂相的75.0%，综上可以判定雄性凤鲚的染色体数目为2n=48，而雌性凤鲚的染色体数目为2n=47。

2.2 凤鲚的染色体核型

通过对凤鲚雌鱼和雄鱼各10个良好的中期分裂相进行显微摄像统计分析，得出凤鲚雌鱼和雄鱼染色体的相对长度和臂比（表2）。按照LEVEN［15］的标准分析，凤鲚的染色体组型为t型（染色体全属于端着丝粒染色体），核型公式为：2n（♂）=48 t，NF=48；2n（♀）=47 t，NF=47。雄性凤鲚染色体相对长度范围为（2.66±0.27）～（5.54±0.25），而雌性凤鲚染色体相对长度范围为（2.83±0.32）～（5.70±0.38），雌雄凤鲚的相对长度无显著差异（P＞0.05），各相邻两对染色体之间相对长度无显著差异（P＞0.05）。

根据表2数据，对染色体形态和相对长度进行分析，按照相对长度由大到小排列，得到雌雄凤鲚的染色体中期分裂相（图1，图2），结果发现：凤鲚雄鱼的染色体可配对成为24对同源染色体，其染色体数为48条；而雌鱼的染色体只能配对为23对同源染色体，其染色体数目为47条，有1条染色体无法进行配对。

表1 凤鲚分裂中期染色体数目统计结果Tab.1 Results of the metaphase chromosome number of Coilia mystus

表2 凤鲚染色体相对长度和臂比值（平均值±标准差）Tab.2 Relative length and arm ratio of chromosome of Coilia mystus（Mean±SD）

图1 雌性凤鲚染色体中期分裂相（左）（×1000），核型图（右）Fig.1 Metaphase chromosomes（left）（×1000），and karyotype（right）of female Coilia mystus

图2 雄性凤鲚染色体中期分裂相（左）（×1000），核型图（右）Fig.2 Metaphase chromosomes（left）（×1000），and karyotype（right）of male Coilia mystus

3 讨论

3.1 凤鲚染色体制备方法的改进

凤鲚属于应激性特别强的鱼类，捕捞出水后存活时间短，其组织细胞的分裂增生能力会随着存活时间不断消减，因此制备凤鲚染色体标本的难度相当大。相同属的刀鲚（C.nasus）和短颌鲚（C.brachygnathus）已有染色体相关报道，其染色体标本制备的主要材料以肾组织为主，其中刀鲚［11］采用了鳃-肾细胞的植物血球凝集素（PHA）-秋水仙素法制备方法，但其结果仅表示了肾细胞，未提及鳃丝细胞制备效果；短颌鲚［16］则按照肾组织细胞培养、空气干燥或火焰干燥法制备标本，二者都仅有肾组织细胞培养环节，并且步骤繁琐，前处理所需时间长，不适用于凤鲚染色体标本的制作。

经过反复摸索，本实验根据凤鲚本身的生物学特性，同时为保持凤鲚组织细胞的活力，采用了一种简单快捷、易于操作的染色体标本制备方法。本方法较体内注射细胞法区别在以下2点：1）采用就近原则，于捕捞现场取样，当场摘取性成熟个体的鳃丝，更好的保持了凤鲚的组织细胞活力；2）KCl低渗液浓度为 0.05 mol·L-1，相对于常用的体内注射法所需的0.075 mol·L-1KCl低渗液，该浓度低渗处理下的染色中期分裂相多，染色体形态和分散度好。同时，本实验也将鳍条作为实验材料，但发现鳃丝比鳍条解离细胞数多，鳍条不是理想的凤鲚染色体标本制备材料。

此外，实验存在一些染色体分裂相为非众数，这可能与鳃丝细胞处理、制备标本的过程中个别染色体缺失或混杂以及计数误差有关。

3.2 凤鲚染色体核型分析

性别决定及分化研究是脊椎动物遗传进化研究的重要部分，其研究备受关注［17］。由于鱼类进化地位特殊，硬骨鱼类的性别决定以及性染色体的研究进展较为缓慢。绝大多数鱼类的性别决定机制原始，除性染色体存在决定性别的基因外，其常染色体有一些基因也参与性别决定［18］。现阶段研究发现，鱼类的染色体性别决定主要类型为XX/XY型和ZW/ZZ型，70%的鱼类都为这两种类型：XX/XY为雌性同配 （XX）、雄性异配（XY），ZW/ZZ为雌性异配（ZW）、雄性同配（ZZ）［19］；而少部分鱼类为 XX/XO型和 ZO/ZZ型，一种性别的鱼中缺失一个性染色体：XX/XO型表现为雄鱼缺失一个性染色体，雌性同配（XX），ZO/ZZ型则表现为雌鱼缺失一个性染色体，雄性同配（ZZ）［9］。本研究发现，雌性凤鲚染色体数目为47条，有1条染色体无法进行配对，这一现象跟刀鲚［11］与短颌鲚［16］的情况相似：雌鱼有一条染色体找不到同源染色体，而雄鱼的这一条染色体可以找到同源染色体，因此凤鲚存在性染色体，其性染色体型为ZO/ZZ型，该类型的性染色体不仅在鱼类中较为少见，在脊椎动物中也很罕见。

凤鲚的染色体组型为t型（染色体全属于端着丝粒染色体），在形态上观察不到明显的区别。本研究对雌雄凤鲚的染色体相对长度进行了对比分析，结果发现不存在显著差异（P＞0.05），从大到小呈连续递减的趋势，这与半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）［20］雌雄染色体对比的结果不同，这一现象可能跟凤鲚和半滑舌鳎的性染色体类型不同有关，半滑舌鳎性染色体类型属于ZW/ZZ型。通过这一发现可以推断出：同为t型的ZO/ZZ型与ZW/ZZ型两种类型的鱼类性染色体不光数目上存在差异，在其雌雄鱼的相对长度对比上也有区别。

根据日本学者小岛吉雄［21］对鱼类染色体3种演化类群的描述发现，真骨鱼类可划分为3种演化类群：低位、中位和高位，鱼类的演化类群进化越高，其染色体数目分布越收敛，端部着丝粒染色体多，臂数少。而本研究发现，凤鲚全部染色体均为端部着丝粒染色体，其染色体数目极为收敛，且臂数为47～48，按照上述划分，应属于高位演化类群，但凤鲚在真骨鱼类中却属于低位演化类群，同属的刀鲚和短颌鲚的染色体分布和端部着丝粒也同凤鲚类似［11，16］，鲚属鱼类在鱼类演变进化过程中是否存在高位和低位之分有待进一步研究。此外，李树深［22］根据染色体的着丝粒染色体位置把鱼类分为两种类群：原始类群，具有较多端部着丝粒染色体；特化类群，具有较多中部或亚中部着丝粒染色体，并且特化类群还分为臂数少的较特化类群和臂数多的特化类群。据此本研究更倾向于凤鲚属于原始类群，在真骨鱼类中是非常原始的。另外，凤鲚的性染色体特别明显，本身却很原始，结合相关研究发现鱼类性染色体的发生及其演化过程和它们的系统演化之间并不存在平行关系［9，21］。综上所述，虽然鱼类在脊椎动物中进化位置最为原始，但由于鱼类在脊椎动物的系统演化过程中处于承前启后的关键地位，演化历史久远，分支繁多，使得在鱼类生命进化历程中会表现出各种不同染色体类型和最为复杂的性别决定机制。

我国鲚属鱼类有凤鲚、刀鲚、七丝鲚（C.grayii）和发光鲚（C.dussumieri）4种，其外部形态和生态习性均较为相似［2］。本研究发现，凤鲚的染色体核型公式为 2n（♂）=48 t，NF=48；2n（♀）=47 t，NF=47，与刀鲚和短颌鲚的研究结果相同［11，16］，这一发现从遗传细胞学的角度解释了这3种鱼类的亲缘关系十分密切，ZO/ZZ型性染色体应为鲚属鱼类的普遍现象。

4 小结

本研究通过活体取鳃制染色体标本技术制备了凤鲚染色体标本，并对其核型进行了分析，其雌性染色体数目为2n=47，雄性染色体数目为2n=48；核型公式为 2n（♀）=47t，2n（♂）=48t；雌性染色体臂数（NF）=47，雄性NF=48。凤鲚存在性染色体，其性染色体类型为ZO/ZZ型，这与刀鲚［11］和短颌鲚［16］的研究结果相同。此结果补充了细胞遗传学数据和凤鲚的种质检验参考数据，从染色体水平为鲚属鱼类的分类与进化角度提供了数据资料。此外，唐文乔等［23］研究表明，短颌鲚为刀鲚的陆封种群，关于两者染色体核型的研究结果显示，刀鲚和短颌鲚染色体数目和核型均一致［11，16］。张世义［2］认为我国凤鲚至少有3个地方种群，即长江型、闽江型和珠江型，其体型及颜色具有较大的差异，且长江型与闽江型［5，9］及珠江型［11］群体间的分化均已达亚种水平。本研究的凤鲚采自长江口，属长江型，3个凤鲚地方种群的染色体核型间是否存在差异还有待进一步的研究。