副猪嗜血杆菌流行病学调查及两株分离株耐药性和致病性分析

邱文彬，于 江，张玉玉，沈文慧，杨 杰，陈 智，孙文博，陈 蕾，张 凡，张丽丽，杨桂文*，吴家强*

(1.山东师范大学 生命科学学院，山东 济南 250014；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东 济南250100；3.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南250100；4.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271000；5.烟台市牟平区动物疫病预防与控制中心，山东 烟台 264100)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)是一种革兰氏阴性细小杆菌，具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性，常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎等症状[1]。该病的发病率通常为10%～15%，严重时高达40%，死亡率可高达50%[2-4]。另外，由于病毒性疾病的入侵和流行造成猪群免疫力下降，免疫抑制性的疾病(如猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等)经常与HPS发生混合感染或继发感染，使疾病的预防与治疗变得更为复杂，给养殖业带来了极大的经济损失[5-6]。

按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)血清分型法, 目前可将HPS分为15个血清型,另有约15.2%～41%的菌株不能分型。HPS在世界各国流行的血清型不尽相同，不同血清型的HPS毒力也有很大差异，引起猪的临床症状亦有差别[7-11]。

目前已有对HPS敏感性药物的筛选及耐药性的相关研究，不同菌株的药物敏感性各有差异[12-16]。刘德成进行的特定菌株牛津杯药敏试验结果表明HPS分离株对乳酸环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考敏感性高，对头孢噻呋钠、氨苄西林、阿莫西林产生了耐药性[12]。魏海林等研究发现HPS分离株对阿莫西林(56.7%)、氨苄西林(63.9%)、青霉素(74.2%)产生了较高的耐药性[13]。由此可见该菌极易产生耐药性，而且不同分离株之间也有差异，抗生素治疗方案面临诸多问题。

本研究采用细菌分离培养结合PCR鉴定的方法对2016-2018年山东省12个地区送检的103个发病猪的病料进行HPS的分离鉴定，并进一步确定其血清型，同时分析该病的发生与季节和猪日龄的关系，以了解副猪嗜血杆菌病的流行情况。通过对HPS分离株LZ株和LC株的培养特性观察、生化鉴定、药敏试验以及动物攻毒试验，确定其最小发病剂量，为该病疫苗研制和防治提供重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 2016年-2018年山东省12个地区(包括聊城、淄博、潍坊、临沂、莱芜等)送检发病猪的病料(包括肺脏、血液、心包液、关节液等)，共103份。来自山东省临淄、聊城两个大型养猪场的HPS分离株分别被命名为LZ株和LC株。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)为美国BD公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为Sigma公司产品；新生牛血清购自济南劲牛公司；微量生化鉴定试剂和药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；HPS标准菌株及阳性血清、金黄色葡萄球菌由山东省农业科学院畜牧兽医研究所保存；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000购自大连宝生物工程有限公司。恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；PTC-2000型PCR仪购自美国MJ Research公司。

1.1.3 试验动物 3～4周龄健康易感仔猪购自山东省滨州市某猪场。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 无菌采集疑似副猪嗜血杆菌病的发病猪病料(肺脏、血液、心包液、关节液等)，接种于TSA培养基上，置于37 ℃培养箱培养，观察细菌菌落特征，挑取圆形、光滑湿润、无色透明的露珠样菌落进行革兰氏染色镜检，将镜检为可疑的菌落进行纯化培养。

1.2.2 培养特性试验 将分离菌分别水平划线接种于鲜血琼脂平板和普通琼脂平板，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线接种，37 ℃培养后观察细菌生长状况。将分离菌分别接种于含0.001% NAD的鲜血琼脂平板，37 ℃培养后观察有无溶血现象。

1.2.3 生化鉴定试验 挑取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落纯化培养后，接种于含NAD的硝酸盐还原、氧化酶、接触酶、吲哚、蔗糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、木糖、甘露醇等微量生化反应管中，37℃培养，观察其生化特性。

1.2.4 PCR鉴定 采用直接煮沸法从HPS分离株培养物中提取DNA[17]，根据Oliveira等[18]报道合成1对特异引物，上游引物为5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，下游引物为5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′,该引物扩增编码16SrRNA长度约为822 bp，由上海生物工程有限公司合成。PCR扩增方法按文献[19]进行。

1.2.5 血清学鉴定 根据蔡旭旺[17]方法制备各分离菌株的血清学分型抗原，以各血清型标准血清对各分离株进行琼脂扩散试验，以确定各分离株的血清型。

1.2.6 药敏试验 将HPS LZ株和LC株的纯培养物制成菌悬液，用灭菌棉签均匀涂布于TSA培养基上，选取多种抗生素的药敏纸片贴于培养基上，置于37℃培养箱，培养24～48 h，测量抑菌环直径。

1.2.7 动物攻毒试验 将HPS LZ株和LC株密集划线接种于TSA培养基，37 ℃培养12～16 h后，将菌液涂布于TSA培养基，37 ℃培养20～24 h后，收集细菌并将菌液的活菌数调整为约3.0×109CFU/mL。参照蔡旭旺的研究结果[20]，采用腹腔注射攻毒，应用4个攻毒剂量进行动物攻毒试验。选取3～4周龄健康易感仔猪90头，随机分成9组，每组10头，4个组别分别以1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL 4个不同剂量腹腔注射LZ株菌液(约3.0×109CFU/mL)和LC株菌液(约3.0×109CFU/mL)，另外1组腹腔注射PBS 2.5 mL作为对照。连续观察2周，记录各组动物体温变化和临床表现，剖检后观察病理变化。同时取病变组织接种培养基进行细菌分离及PCR鉴定。

2 结果与分析

2.1 山东地区副猪嗜血杆菌病流行病学调查和血清型鉴定结果

共分离获得29株HPS分离株。采用琼脂扩散试验对29株HPS分离株进行血清学分型，结果如表1所示，28株分离菌株可以确定血清型，1株不与15种血清型当中任何血清型发生反应。血清学分型结果显示，在山东省以血清4型(27.6%)和5型(20.7%)最为流行，其次是血清1型(13.8%)、12型(13.8%)、13型(10.3%)，而血清2、10、14型各分离到1株，血清3、6、7、8、9、11、15型目前尚未分离到菌株。来自山东临淄、聊城两个大型养猪场的LZ株和LC株的血清型分别为血清型5型和1型。

统计显示发病时间主要集中于每年的3、4、10、11月份(表2)，发病猪中有8例日龄为0～30 d，18例日龄为31～50 d，3例日龄为51～80 d。

表1 HPS分离菌株血清型鉴定结果Table 1 Results of serotype of HPS strains identified

注：阳性率=(阳性数/分离株数)×100%。下同。

Note：Positive rate = (number of positive isolates / total number of isolates) × 100%.The same below.

表2 不同月份HPS分离菌株的检出情况Table 2 The detection of HPS strains identified

2.2 分离株PCR鉴定结果

用HPS特异性引物进行PCR扩增，从菌液和病猪组织中均获得了长度为822 bp的DNA片段，与试验预期吻合(图1)。PCR产物由上海生工进行测序，所得序列在GenBank中进行BLAST比对，同源性达到98%以上。可确定29株分离株均为HPS。

2.3 形态学观察结果

分离株在TSA固体培养基上，可长出较多的圆形、光滑湿润、无色透明的露珠状小菌落(图2)。取上述菌落涂片，革兰氏染色后镜检观察，细菌为革兰氏阴性的细小杆菌，呈球杆状、短杆状、长杆状、间或丝状等多种形态(图2)。

2.4 培养特性试验结果

LZ株和LC株在鲜血琼脂平板和普通琼脂平板上均不生长，但在鲜血琼脂平板上与金黄色葡萄球菌同时培养时，均在金黄色葡萄球菌线两侧长出针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落，呈现出“卫星生长现象”。在含NAD的鲜血琼脂平板上也可形成灰白色透明、针尖大小且不溶血的微小菌落。

2.5 生化鉴定试验结果

结果表明LZ株和LC株对硝酸盐还原、接触酶、葡萄糖、果糖的发酵结果均为阳性；对吲哚、氧化酶、甘露醇的发酵结果均为阴性。其余发酵结果均为部分阳性。该试验结果表明LZ株和LC株均符合HPS的生化特性。

2.6 药敏试验结果

结果显示多种抗生素可使LZ株和LC株产生抑菌环(图3)，其中LZ株对青霉素类、头孢类等药物高度敏感，对庆大霉素、卡那霉素等中度敏感，对林可霉素、链霉素低度敏感；LC株对青霉素类、头孢类等药物高度敏感，对庆大霉素、林可霉素等中度敏感，对卡那霉素、链霉素低度敏感(表3)。

2.7 动物攻毒试验结果

2.7.1 攻毒仔猪的临床症状 用不同剂量的LZ株和LC株对仔猪分别攻毒后，大部分仔猪体温在攻毒第2日或第3日开始升高，持续2～5 d后，体温逐渐恢复正常(图4)。HPS的攻毒剂量越大，试验猪的最高体温越高，死亡越快。对照组仔猪体温均正常。攻毒后的大部分仔猪不同程度地出现被毛粗乱、精神不振、食欲减退等症状，部分攻毒仔猪还伴有咳嗽、呕吐，以及后肢膝关节肿胀、右后肢跛行、卧地不起、临死前侧卧转圈或前肢呈划水样等临床症状(表4)。向仔猪注射相同攻毒剂量的LZ株和LC株菌液后，注射LZ株菌液的仔猪发病更早，并且死亡率更高。

表3 常见抗生素对HPS LZ株和LC株的抑菌圈大小Table 3 Inhibition circle size of common antibiotics against HPS LZ strain and LC strain mm

2.7.2 攻毒仔猪体内HPS的分离鉴定 取发病死亡仔猪的心包积液、胸腔积液、腹腔积液和心血分别接种于TSA培养基上，经37 ℃培养24～48 h后，长出菌落后经革兰氏染色为革兰氏阴性短杆菌。经PCR鉴定，从攻毒后发病猪分离出的细菌分别与LZ株和LC株一致，PCR扩增产物电泳结果见图5。

2.7.3 攻毒仔猪的病理特征及不同浓度菌液的致病率比较 LZ株和LC株均能引起严重的纤维素性渗出，解剖发病猪可见经典的“绒毛心”和腹膜炎症状(图6)，除此之外部分发病猪还出现心脏和肺脏粘连、淋巴结肿大、腹腔粘连、关节液增多、肺脏出血、脑膜出血、脑膜炎、浆膜炎、胸腔和心包内积液且浑浊、肺脏肉变、肺脏表面有出血点、心脏表面或胸腹腔内有纤维素性渗出物、关节液增多等病理特征。不同剂量LZ株和LC株对仔猪进行攻毒，其发病率和死亡率见表5。试验仔猪的发病率和死亡率随着HPS攻毒剂量的加大而增高。试验结果显示，LZ株选用1.5 mL菌液(约3.0×109CFU/mL)进行攻毒可使100%仔猪发病，LC株选用2.0 mL菌液(约3.0×109CFU/mL)进行攻毒可使100%仔猪发病。

表4 LZ株、LC株不同攻毒剂量仔猪的临床症状Table 4 Clinical symptom of piglets injected with different doses of LZ and LC strains

图5攻毒发病猪分离的细菌PCR鉴定结果
M.DL2000 DNA Marker；1～5.LZ株攻毒；
8～12.LC株攻毒；6.阴性对照；7.阳性对照
Fig. 5 PCR identification of bacteria isolated from infected pigs
M.DL2000 DNA Marker; 1～5.Infected with LZ strains;
8～12.Infected with LC strains; 6.Negative control;
7.Positive control

图6LZ株和LC株引起的剖检变化
A，C.胸膜炎和绒毛心；B,D.腹膜炎
Fig. 6 Changes in necropsy caused by LZ and LC strains
A，C. Pleurisy and villus heart; B, D. Peritonitis

因此，本次动物攻毒试验中，LZ株菌液的最小发病量为4.5×109CFU，LC株菌液的最小发病量为6.0×109CFU。

3 讨 论

副猪嗜血杆菌病为危害现代养猪业的重要传染病之一，在世界范围内引起了广泛重视。本研究对103份疑似病料进行检测，结果显示HPS的分离率约为28.16%。不同地域和养殖环境中，HPS的各种血清型的流行情况也不尽相同，虽然流行情况各有差异，但统计结果表明4型和5型HPS最为流行[6,17]。本研究确定了当前山东地区流行的HPS主要是血清4型和5型，其次是1、12型，说明目前该病的血清型流行情况相对稳定。

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，正常条件下不致病，但在断奶、通风不良、气温剧变、混群、长途运输等各种应激因素的作用下，破坏其上呼吸道的防御机制，引起上呼吸道粘膜的损伤，从而导致敏感猪发生全身感染。该病一年四季均可发生，但在早春(3、4月份)和深秋(10、11月份)由于昼夜温差大及通风不良等原因，更易暴发流行。副猪嗜血杆菌易感2周龄到4月龄的猪，但以5～8周龄的断奶保育仔猪最为多见。本研究也发现发病猪多集中于31～50日龄，这与仔猪的早期断奶养殖模式及其母源抗体的消长规律有关。

抗生素的不合理使用以及抗菌药物的选择压力等因素加重了细菌的耐药性[21]，据国内外研究表明，HPS耐药性广泛，对不同药物的敏感性亦有地域性差异。大多数HPS已经对林可霉素、四环素和红霉素产生抗性[22]。刘玉英[14]的研究结果表明HPS对氯霉素和头孢噻柄敏感,对阿莫西林和氨苄青霉素等产生了耐药性。Martín de la Fuente等[15]的研究结果表明所有英国HPS分离株均对青霉素、头孢噻呋、红霉素、替米考星、恩诺沙星和氟苯尼考敏感，所有西班牙分离株仅对氟苯尼考敏感，对青霉素等耐药率较高。Zhou等[23]对此也进行过研究报道，HPS对恩诺沙星产生抗性，对头孢噻肟、头孢噻呋、阿奇霉素、氯霉素、氟苯尼考和替米考星等敏感，可用于副猪嗜血杆菌病的治疗。Aarestrup等[16]进行耐药性研究试验中的所有HPS分离株均对氨苄西林、环丙沙星、头孢噻呋、红霉素等没有抗性，其中两种分离株对甲氧苄氨嘧啶+磺胺甲恶唑有耐药性，部分分离株对环丙沙星和TMP+磺胺甲恶唑的敏感性降低。另外，Sun等[24]发现马波沙星对HPS具有抗菌活性，并测定了198株HPS分离株的最小抑菌浓度(MIC50为2 mg/L，MIC90为8 mg/L)。本研究中，LZ株和LC株均对青霉素类、头孢类等药物敏感性高，LZ株对林可霉素、链霉素敏感性低，LC株对卡那霉素、链霉素低敏，菌株耐药性与上述研究结果部分吻合，但亦有差异，为HPS不同菌株的防治提供了依据。抗生素种类繁多，HPS各菌株对不同种类抗生素的耐药性差异较大，而且同一种菌株的耐药性也会发生变化，因此对HPS菌株的耐药性进行及时、广泛和精准的检测对副猪嗜血杆菌病的治疗尤为重要。

表5 LZ株、LC株不同攻毒剂量仔猪的发病和死亡情况Table 5 Incidence and mortality of piglets injected with different doses of LZ and LC strains

注：a.出现食欲减退、精神沉郁、咳嗽、呼吸困难和被毛粗乱等临床症状；b.体温升高0.5 ℃以上，并持续2～5 d；c.剖检出现心包积液、腹水增多、胸腔或腹腔内有纤维素性渗出物，肺脏出血或肉变、淋巴结肿大、后肢关节腔内关节液增多等病理变化。

Note：a. indicates that the attacked pig has clinical symptoms such as anorexia，mental depression，cough，dyspnea and the coat is rough and disorder；b. indicates that the body temperature rises above 0.5 ℃ and lasts for 2 to 5 days；c. indicates the results of the necropsy，including the pericardial effusion，ascites increased，fibrinous exudate in the thoracic or cavum abdominis，pulmonary hemorrhage or sarcoidosis，lymphadenectasis，increased synovial fluid in the Hindlimb articular cavity，and so on.

王乐等[11]进行的豚鼠和仔猪HPS毒性试验结果表明，12和14型毒力最强(LD50低于3.5×108CFU)，其次是血清型5型，13型毒力最弱，4型菌株间有差异，研究结果与国外研究报道部分相一致[25]，说明部分血清型与毒力之间可能存在一定的联系，也有研究表明HPS的血清型和致病型与基因组水平的差异有关[26]，基因组水平的差异对毒力起决定性影响。本试验用不同剂量的LZ株和LC株对仔猪分别攻毒，解剖病理特征与尹秀凤[8]、Zhang等[27]的研究发现部分相吻合，攻毒后仔猪的临床症状包括体温明显升高、被毛粗乱、精神不振、呼吸困难、咳嗽、卧地不起等，解剖发病猪的病理特征包括“绒毛心”和腹膜炎等。本研究还确定了LZ株和LC株的动物攻毒试验的最小发病量，证明两者都具有较强的毒性，对分离株的致病性进行研究有着重要意义，可为该病的疫苗研制和综合防治提供理论依据。

4 结 论

本研究对山东省12个地区的发病猪场的副猪嗜血杆菌病进行了流行病学和血清学调查，并用其分离株LZ株和LC株进行了生物特性和动物致病性试验。结果显示山东地区确有副猪嗜血杆菌病的流行(分离率为28.16%)，其中4型和5型血清型最为流行。研究发现LZ株和LC株毒力较强，且均对青霉素类、头孢类等药物有较高的敏感性。本研究为副猪嗜血杆菌病菌病的诊断与防治提供了重要依据，具有一定的临床应用和理论价值。