气相色谱中温度程序和样品浓度对乳样中C18脂肪酸分离效果的影响研究

熊一键，王晨昱,魏冉月,孙小琴

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

随着人们对膳食脂肪酸组成与人体健康关系认识的加深，乳和乳制品的脂肪酸组成调控研究备受关注，而准确分析乳样的脂肪酸组成则是此类研究的基础[1]。各种脂肪酸的良好分离是进行脂肪酸定性和定量分析的前提。乳中的脂肪酸种类众多且含量变异较大[2]，尤其是含有18个碳原子的C18脂肪酸，除了不含双键的硬脂酸(C18:0)外，还存在多种含有1～6个不等双键的单不饱和与多不饱和脂肪酸，且这些脂肪酸每一种都存在多个由于双键位置和双键顺、反式结构不同的同分异构体，种类众多、结构复杂，其主要原因是瘤胃微生物对饲料中亚油酸(C18:2n-6)和亚麻酸(C18:3n-3)的不完全氢化、异构化以及乳腺组织对该类脂肪酸的去饱和作用[3-4]。乳中C18脂肪酸的种类及其含量既与人体健康密切相关，又反映着动物瘤胃和乳腺组织中的脂肪酸代谢，因此，对其进行准确分析对于反刍动物乳脂代谢调控研究至关重要。

然而，乳中C18脂肪酸的同分异构体受动物品种、饲料组成等多种因素影响，含量变异较大，分离难度极大，尤其是一些含量较低但具有重要生物学意义的脂肪酸，如含t10双键的C18:1和C18:2同分异构体。该类脂肪酸含量的增加被认为与瘤胃脂肪酸代谢异常和乳脂品质降低以及奶牛乳脂合成过程被抑制有关[5]，但这类脂肪酸正常情况下在乳脂中含量极低，气相色谱(Gas chromatography, GC)分离条件不适宜时，t10脂肪酸的峰往往被周围含量较高的脂肪酸峰掩盖而无法分离，影响研究结果甚至会导致错误的研究结论。有研究报道认为GC的温度程序会影响C18脂肪酸的分离效果[6-7]。除了现有分析中最常用的175 ℃升温程序外，有研究表明150 ℃升温或170 ℃等温程序更有助于C18脂肪酸的分离[8]。而本实验室多年的脂肪酸分析实践发现，样品浓度可能也会影响C18脂肪酸的分离效果。因此，为了更好地分离乳样中的C18脂肪酸，以便对其准确鉴定和定量，本试验选择了4种来源不同的乳样，比较研究3种温度程序(175 ℃、150 ℃、170 ℃)和3种样品浓度(提取的原液、2倍稀释液、5倍稀释液)对其中C18脂肪酸分离效果的影响，旨在为相关研究中C18脂肪酸测定方法的建立提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试验处理

本试验选择8个乳样，其中5个来自本实验室前期的一个饲养试验，乳脂特性比较一致，另外3个分别为采自西北农林科技大学生态养殖基地的鲜牛奶、鲜羊奶和自超市购买的某品牌袋装乳样，乳脂特性差异较大。首先将所选乳样取1 mL冻干后进行甲酯化处理并用2 mL正己烷提取脂肪酸甲酯(详细步骤见1.2)，制成每种乳样的原液，然后取一定量原液用正己烷进行2倍和5倍稀释，得到2倍和5倍稀释液。最后，对所有样品的原液和稀释液用表1所示的3种温度程序分别进行GC分析，比较不同温度程序和样品浓度对乳样C18脂肪酸分离效果的影响。

1.2 脂肪酸测定方法

样品脂肪酸的酯化采用直接酯化法进行[9]，具体方法为：取1 mL乳样于10 mL玻璃试管中，-80 ℃冷冻并冻干。加入50 μL的内标C19:0甲酯，4 mL 0.5 mol/L的NaOH/甲醇溶液，混匀，于50 ℃水浴加热15 min，冷却后加入4 mL 2% H2SO4/甲醇溶液，混匀后于50 ℃水浴加热1 h，冷却后加入2 mL正己烷和2 mL蒸馏水，混匀，3 500 r/min离心5 min，取0.5 mL上层的正己烷层于GC小瓶中，作为原液于-20 ℃保存。另取2份0.25 mL正己烷层样品与GC小瓶中，用正己烷进行2倍和5倍稀释，-20 ℃保存。

样品的脂肪酸分析用GC(安捷伦7820a, Agilent Technologies,千川，陕西)进行，色谱柱为Selected CP 7420毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm，Agilent Technologies)。GC条件：氮气作为载气，分离比30：1，进样器和检测器均为260 ℃，色谱柱温度程序如表1所示。主要C18脂肪酸的鉴定用ME61作为外标 (Larodan Fine Chemicals AB, Sweden)，而多众多无商业外标的C18:1 (trans-4, trans-5, trans-6/7/8, trans-9, trans-10, trans-11, trans-12, trans-13, cis-9, trans-15, cis-11, cis-12, cis-13, trans-16, cis-15)、C18:2 (trans-9trans-12，cis-8trans-13，trans-8cis-13，cis-9trans-12，trans-9cis-12, trans-11cis-15) 脂肪酸的鉴定参考Loor等[10]报道的C18脂肪酸图谱进行。

表1 气相色谱温度程序Table 1 The Gas chromatograph temperature programs

2 结果与分析

2.1 175 ℃升温程序对不同特性乳样原液C18脂肪酸的分离效果

乳脂性质相近(图1)和相异(图2)乳样中C18脂肪酸的分离效果图表明，175 ℃升温程序能分离大部分C18脂肪酸，对C18:2脂肪酸的分离差异不大，但对C18:1脂肪酸的分离效果不同。由图2可知，乳脂特性不同的乳样，其C18脂肪酸含量差异很大，且分离效果不同。在175 ℃升温程序下，试验所用的鲜牛奶、鲜羊奶中的C18:1t5～t9同分异构体呈一个峰形出现，分离效果较差，且t10与t11同时出峰，无法分开，而袋装牛奶样和前期试验牛奶样可部分出现C18:1t10峰形(图2箭头所示部分)，但与C18:1t11间的分离效果并不是很好。因此，不同特性的乳样原液在同一温度程序下的分离效果不同，且在175 ℃升温程序下不能很好地分离C18:1t5～C18:1t11同分异构体。

2.2 温度程序对乳样C18脂肪酸分离效果的影响

由图3可知，3种温度程序对C18:1脂肪酸的分离效果差异很大且各有特点：就C18:1t6～t10的分离效果而言，以150 ℃升温程序最好，同时，还可将C18:1t16与C18:1c15分离开，但该程序也有缺陷，不能从C18:1c9中洗脱出C18:1t12/13/14和C18:1t15；与150 ℃升温程序相比，170 ℃等温程序和175 ℃升温程序对C18:1t6～t10的分离效果都较差，但170 ℃等温程序可将C18:1t12/13/14和C18:1t15从C18:1c9中分离出来，而175 ℃升温程序则只可分离出C18:1t12/13/14，无法分离C18:1t15。

3种温度程序对C18:2脂肪酸的分离效果(图4)主要在于改变了C18:2c9t12和C18:2t11c15脂肪酸的出峰顺序。其中，在170 ℃等温程序中，C18:2c9t12和C18:2t11c15在C19:0与C18:2n-6之间出峰，且分离效果不佳；在175 ℃升温程序中，C18:2c9t12和C18:2t11c15的分离较好，且C18:2c9t12的出峰在C19:0之前；而在150 ℃升温程序中， C18:2c9t12和C18:2t11c15的出峰在C19:0之前，但分离效果不佳。相对而言，175 ℃升温程序C18:2c9t12和C18:2t11c15的分离较好。

2.3 样品浓度对乳样C18脂肪酸分离效果的影响

由图5和图6可知，样品浓度对C18:1脂肪酸分离的影响主要体现在对C18:1t6～C18:1t11的分离效果上(图5)：在各种温度程序下，原液中的C18:1t6～C18:1t11分离效果均不如2倍和5倍稀释液，尤其是170 ℃等温程序和175 ℃升温程序中。在150 ℃升温程序下，2倍和5倍稀释液的分离效果明显优于原液，且C18:1t12/13/14在低浓度时也可以被溶出。同时，随着样品稀释， 175 ℃升温程序对C18:1t12/13/14的分离效果也更好。样品浓度对C18:2脂肪酸分离效果的影响较小(图6)，但是含量较低的脂肪酸如C18:2c9t12和C18:2t11c15在5倍稀释液时峰高水平接近基线，很难鉴定。综上所述，原液的C18:1脂肪酸分离效果最差，5倍稀释液对C18:1脂肪酸分离效果最好，但是对C18:2脂肪酸分离效果最差。而2倍稀释液的分离效果最均匀，对C18:1脂肪酸和C18:2脂肪酸均可以很好地分离。

3 讨 论

3.1 温度程序对乳样C18脂肪酸分离效果的影响

众所周知，由于脂肪酸的碳链长度、双键数目、几何异构体、官能团等的不同，在GC分析时其溶出温度不同。已知C18脂肪酸的同分异构体对于色谱柱温度非常敏感，几摄氏度的差异就可能导致某些顺、反式脂肪酸丢失或与其他同分异构体重叠出峰[11]。因此，GC色谱柱的温度程序对C18脂肪酸的分离程度有重要影响。目前，在175 ℃的温度平台保持27 min是最常用的C18脂肪酸溶出温度，该温度平台能够很好地分离出绝大部分的C18脂肪酸同分异构体，但对C18:1t6～t11脂肪酸分离效果不够理想。研究指出，将色谱柱的温度从175 ℃降低至163 ℃、150 ℃[7]甚至120 ℃[5]，可以改善C18:1t6～t11的分离效果，而使用170 ℃等温程序，即在170 ℃保持75 min也能够改善C18脂肪酸同分异构体的分离效果[8]。本试验对常用的175 ℃升温程序、低温条件下的150 ℃升温程序和170 ℃等温程序的比较表明，C18:1脂肪酸的分离效果受温度程序影响更明显，尤其是C18:1t6～t11、C18:1t12/13/14、C18:1c15、C18:1t15等同分异构体，且不同温度程序的影响不同。在三种温度程序中，150 ℃升温程序对C18:1t6～t11同分异构体的分离效果最好，且该程序能够分离出C18:1c15；175 ℃升温程序和170 ℃等温程序不能很好地分离C18:1t9与C18:1t6/7/8，且存在C18:1t10和C18:1t11共同洗脱溶出的情况，但这两个温度程序均能够将C18:1t12/13/14从C18:1c9溶出，而后者还能从C18:1c9中分离出C18:1t15。上述结果与Kramer等[7]对不同温度程序分离效果的比较结果相同，说明温度程序是影响C18:1脂肪酸分离效果的重要因素，同时也表明很难有一种完美的温度程序来实现所有C18:1脂肪酸的理想分离，根据试验目的选择合适的程序温度，或者将多种温度程序相结合，尤其是将175 ℃升温程序和150 ℃升温程序相结合，可以获得绝大部分C18:1同分异构体的良好分离。鉴于不同温度程序主要影响C18:2脂肪酸的出峰顺序，所以在脂肪酸分离中，可以不考虑温度程序对C18:2脂肪酸分离效果的影响。

3.2 样品浓度对乳样C18脂肪酸分离效果的影响

本实验室长期的脂肪酸分析实践发现，同样的温度条件下，有些样品的C18:1脂肪酸尤其是t6～t11同分异构体能够分离良好，而有些样品的分离效果却很差，我们认为可能与样品本身的脂肪含量或某些脂肪酸含量高低有关。基于此，本试验比较了不同温度条件下样品浓度对C18脂肪酸分离效果的影响。试验结果与预期相符，样品浓度影响乳样中C18脂肪酸的分离效果，且C18:1尤其是C18:1t6～t11脂肪酸的分离效果随着样品浓度降低而改善，这一结果与早期Wolff和Bayard[11]报道中有关C18:1t15分离时应降低进样量和样品浓度，以防止其被过高的C18:1c9峰所覆盖的观点一致。在本试验样品处理条件下，鉴于原液的分离效果较差而5倍稀释液会导致一些含量过低的脂肪酸消失或峰高接近基线，推荐在用乳样制备GC分析样品时，可在本研究所用方法的提取步骤后再增加一步2 mL正己烷提取，这样，相当于使用了本研究中的2倍稀释液。但考虑到不同乳样乳脂特性差异较大，分析时还应根据样品特性首先确定适宜的分析浓度，以既保证各种同分异构体的良好分离、又保证较低含量脂肪酸能够有足够的峰高为宜，或者采用多个样品浓度相结合的方法也可以完善乳样脂肪酸的分析结果。

4 结 论

乳样GC分析中，色谱柱的温度程序主要影响C18:1脂肪酸的分离效果和C18:2脂肪酸的出峰顺序，且各具优势。降低样品浓度可以改善C18:1脂肪酸的分离效果，但浓度过低会造成一些含量过低的脂肪酸丢失。综合而言，按本研究的提取法对乳样进行2倍稀释，并根据试验目的采用多种温度程序相结合的方法，可实现乳样C18脂肪酸的理想分离。