异位发酵床垫料利用期限及微生物组成差异分析

潘孝青，邵 乐,李 波，于传军，顾洪如*，秦 枫，杨 杰，张 霞，李 健,严 康

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014；2.江苏省淮安市淮阴区动物卫生监督所，江苏 淮安 223227；3.江苏省畜牧总站，江苏 南京 210014；)

异位发酵床是为适应畜禽养殖粪污治理需要而建立的，在处理猪粪污方面，异位发酵床与堆肥原理相似，但异位发酵床处理粪污时，需在一段时间内多次向床体中添加粪污以达到处理目的，此方面则不同于堆肥。异位发酵床由发酵槽、垫料、微生物菌剂、翻抛设备、喷淋设备、粪污管道、防雨棚等组成[1]。异位发酵床利用谷壳、木屑、菌糠等作原料，加入微生物发酵剂，混合搅拌，铺平在发酵池内，将粪污直接喷洒在发酵床上，利用自动翻抛机，使粪污和垫料充分搅拌混合，调整垫料湿度在40%～60%，通过搅拌增加垫料通气量，有利于微生物充分发酵，同时产生较高的温度(50～70 ℃)将水分蒸发，多次喷洒粪污持续循环发酵，最终转化产生有机肥。异位发酵床的建设和管理决定了污染治理效率和效益[2-5]。

异位发酵床功能的发挥主要依赖于微生物作用[6-8]，而微生物的群落结构变化可以反映出发酵床的运行情况。发酵床发酵初期微生物数量较低，随着发酵床内不断添加养殖废弃物，垫料中可直接利用的养分较多，微生物迅速繁殖，此时细菌、真菌数量快速增加。同时，大量微生物分解粪尿及垫料中的有机物释放的热量导致床体温度迅速升高。初期床体中的大量微生物分解能力较强，床体持续高温使得水分蒸发较快，填入的猪粪和废水被微生物快速分解和消耗。一段时间以后，细菌和真菌的数量均下降[9-10]。进入发酵后期，床体主要营养成分含量逐渐降低，可直接被微生物利用的养分迅速减少，微生物的群落结构变化发生变化，此时则需要通过翻抛、添加新鲜垫料及补充菌剂的方式调整微生物群落结构，使床体恢复分解能力，提高粪尿降解的效率，降低“死床”风险[11-14]。

本文从微生物构成的角度，剖析异位发酵床使用临界点的垫料微生物组成，详细分析熟化垫料不同高度下微生物在门、科、属水平的种类差异，并列出特异差异菌，为后续在生产实践中大面积使用功能发酵菌提供一定指导。

1 材料与方法

1.1 试验异位发酵床设计与床体制备方法

试验在江苏盱眙县白鹤村温氏养殖小区进行，异位发酵床由发酵池、翻抛机、喷淋机等构成。发酵池宽度为5 m，深度为1.4 m，长度为60 m，由4个发酵池组成，床体上部架设粪污喷淋机和有轨行走的翻抛机。发酵床一侧设有变池轨道装备，翻抛机可横向运动，通过变池轨道从一个池变轨道至另一个池，继续作业。为防雨水等进入发酵床，床体顶部建有防雨钢构大棚，其长度与发酵池相同(图1)。

试验垫料选择通透性强、吸湿性好的木屑、稻壳和菌糠组成，按比例15%、15% 和70%混合，均匀铺设于4个发酵池内，铺设高度为1 m。加水及适当自配菌种后混合，调节水分含量至45%，72 h后测定床体20 cm处温度，达到60 ℃后开始打开喷淋机，按既定程序将集污池中的粪污抽排至4个床体中。

1.2 床体管理方法

按上述方法制备好异位发酵床后72 h、床体20 cm处温度达到60 ℃后开始启动喷淋机，按既定程序将集污池中的粪污抽排喷淋至4个床体中，每个喷头对准一个发酵池，喷淋机边行走边把集污池中的粪污喷淋在发酵床垫料上，喷淋机与翻抛机共享同一套行走轨道，一次作业完成一个来回的粪污浆喷淋后，喷淋机返回发酵床一端的喷淋机架上，随后启动翻抛机，其行走速度为4 m/min，20 min完成40 m往返行程。如此往复1次，完成粪污的喷淋、翻抛混合作业。粪污抽排喷淋次数为1次/d，翻抛次数为3次/d，深度为0.9 m，翻抛时间分别为8:00、13:00和17:00。试验开展期间未添加新垫料。

1.3 试验设计

1.3.1 每日粪污喷淋量 为控制床体发酵过程，首次从集污池内抽排至床体的粪污总量标准为：床体50 cm处垫料水分含量升至50%。每日粪污喷淋量为：床体垫料体积：每日粪污喷淋量=30∶1。喷淋时间为每日7∶30开始。

1.3.2 试验周期 试验周期为2017年8月15日-2017年11月15日。本次试验目的之一是通过测定不同发酵时间段的床体温度，进而评价床体利用时间，因此，在试验周期内，以日为单位，每天定时测定床体温度，方法为每日首次翻抛后对床体20 cm深处温度进行测定，每次共记录10个点。翻抛处理后，垫料温度与前期相比显著降低，即判定该异位发酵床垫料已熟化。

1.3.3 采样方法 2017年11月15日试验结束时，床体垫料高度由初始时1 m降至60 cm。此时在床体左侧10 m处、床体中部30 m处和床体右侧10 m处的剖面位置进行采样，分别收集离床体底部50 cm、30 cm和10 cm处的垫料各1 000 g，获得9个不同位置、不同高度下的垫料样品，具体采样方案见表1，4 ℃保存次日交北京百迈客公司进行熟化垫料细菌及真菌微生物测序分析。

1.3.4 微生物分析方法 提取垫料样品总DNA后，根据保守区设计引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序[17-20]。

利用双末端测序(Paired-End)的方法，通过对 Reads 拼接过滤，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，并进行物种注释及丰度分析，揭示熟化垫料不同空间高度微生物构成，挖掘不同空间下的垫料微生物差异[21-22]。

表1 垫料样品采样方法Table 1 Colltction method of bedding sample

1.4 数据处理

测序数据的获取及分析: 利用Qiime ( version 1. 9. 0) 对原始序列进行过滤处理，得到所有优质序列，随后利用Usearch ( version 8. 0) 去除所得嵌合体已获得有效序列。

OTU即分类操作单元，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系、种、属、分组等)设置的同一标志。根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，一般情况下，如果序列之间的相似性高于97%就可以把它定义为一个OTU，每个OTU对应于一种代表序列。使用QIIME[15](version 1.8.0)软件中的 UCLUST[16]对Tags在97%的相似度水平下进行聚类、获得OTU。

OTU聚类:利用Uparse软件对所有样品的全部Clean Reads进行聚类，以97%相似度为阈值将序列聚类成OUT，同时会选取OTU的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTU中出现频数最高的序列作为OTU的代表序列。

物种注释: 细菌16SrRNA 基因V3-V4区采用Sliva细菌数据库比对。采用QIIME平台软件和RDP classifier算法，选择置信度阈值≥0.9进行物种注释和丰度分析。

数据通过SPSS 19.0软件单因素方差分析进行统计，使用Duncan's法对平均值进行多重比较和显著性检验，结果以“平均值±标准误”表示。以P<0.05表示差异显著或相关性显著，P<0.01表示差异极显著或相关性极显著。

2 结果与分析

2.1 异位发酵床垫料利用期限判定

试验开始85 d～90 d期间，对床体进行日常翻抛处理后进行床体20 cm处温度测定，发现垫料温度逐渐降低至30 ℃，据此判定该异位发酵床垫料已熟化，推断采用木屑15%混合、稻壳15%和菌糠70%混合组成垫料高度为1 m的异位发酵床处理猪粪污时，期间不额外添加垫料情况下，床体垫料熟化时间约为90 d，熟化后的垫料可作原料进行有机肥生产(图2)。

2.2 熟化垫料不同高度下微生物OTU数量差异

不同高度下异位发酵床熟化垫料中细菌与真菌微生物OTU数量测定结果如表2所示。离床体底部50 cm、30 cm和10 cm处细菌微生物OTU数量与离床体底部50 cm、30 cm和10 cm处真菌OTU数量相比，分别增加135.75%、180.96%和112.26%；离床体底部50 cm的细菌微生物OTU数量与离床体底部30 cm及10 cm处细菌微生物OTU数量相比，分别增加34.13%和110.64%；离床体底部50 cm的真菌微生物OTU数量与离床体底部30 cm及10 cm处真菌微生物OTU数量相比，分别增加59.67%和89.66%。

2.3 熟化垫料不同高度下细菌微生物在门、科、属水平的种类差异

表2可见，本次试验获得的熟化垫料中的微生物组成以细菌微生物为主，因此本文详细分析熟化垫料不同高度下细菌微生物在门、科、属水平的种类差异，并列出差异菌。

熟化垫料不同高度下细菌微生物在门水平的种类如图3所示，垫料熟化时，细菌微生物种类在门水平上，离床体底部50 cm 处以放线菌 (Actinobacteria)为主，离床体底部30 cm处出现了芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，而此时床体上下50 cm和10 cm处均未出现。

熟化垫料不同高度下细菌微生物在科水平的种类如图4所示，垫料熟化时，细菌微生物种类在科水平上，瘤胃菌科 (Ruminococcaceae)细菌仅出现在离床体底部50 cm处。，高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae)仅出现在在离床体底部10 cm处。

熟化垫料不同高度下细菌微生物在属水平的种类如图5所示，垫料熟化时，细菌微生物在属水平上，产己酸菌属 (Caproiciproducens)仅出现在离床体底部50 cm处，高温放线菌属(Termoactinomyces)仅出现在离床体底部10 cm处。

表2 熟化期不同高度异位发酵床垫料细菌与真菌微生物OTU数量差异Table 2 Differences in bacterial and fungal microbial OTUs between different heights of ectopic fermented mattresses during fertilizer maturity

3 讨 论

异位发酵床粪污处理技术是2018年农业农村部十项重大引领性农业技术之一，与采用高投入的工业标准进行粪污处理从而实现畜禽养殖企业达标排放相比，采用异位发酵床的方式处理畜禽粪污，是一种经济适用的方法，但由于垫料来源多样、床体管理方式差异大等因素，导致异位发酵床在实际使用过程中经常出现“死床”现象。国内学者主要围绕异位发酵床管理、设计等方面开展研究，随着应用面增加，其利用期限已凸显成为限制异位发酵床进一步推广使用的瓶颈。

温度是反应发酵床变化最为直观的指标，也是评价异位发酵床“死床”的客观指标之一。发酵床床体的温度来源于发酵床中的微生物作用，床体中的大量微生物通过利用猪粪尿及垫料中的有机质释放生物质热，使发酵床温度升高[23-25]。本文通过限制垫料种类、粪污添加量等条件，以床体温度为“死床”时的判定标准，获得了特定垫料组成下的床体利用期限，为进一步推广使用异位发酵床治理猪场粪污提供了数据支撑。

国内学者李艳苓[26]认为发酵床垫料中细菌基本维持在107～109数量级，真菌维持在 103～106数量级，起主要作用的是细菌。这与本文结果相似，但其并未详细探讨异位发酵床使用后期的细菌微生物组成，本研究结果表明，在“死床阶段”，床体上部以瘤胃菌科的产己酸菌属细菌为主，这与陈倩倩[27]的研究结果一致，她认为瘤胃菌科含量增加，可作为垫料更换的信号，但其结果并未详细说明瘤胃菌科内某一确定属性的微生物种属类型。本文所获得的瘤胃菌科的产己酸菌属细菌属厌氧菌，据此判断，在“死床”时水分已填满垫料空隙部位，导致大量需氧或兼性厌氧的细菌无法存活。这一结果提示在使用异位发酵床处理猪粪污过程中，应注意提高翻抛效率，增加床体内部氧含量，从而增加微生物种类，提高微生物丰富度，加速粪污降解速率，减少因床体内氧气含量不足而造成的死床现象发生。

4 结 论

采用15%木屑、15%稻壳和70%菌糠混合组成垫料高度为1 m的异位发酵床处理猪粪污，在不额外添加垫料情况下，床体垫料熟化时间为90 d，这一结果为采用异位发酵床技术处理规模猪场时的床体利用期限问题提供了参考。本文从微生物构成的角度，剖析异位发酵床使用临界点的垫料微生物组成，并获得了床体“死床”时的标志性微生物种属，为研发高效异位发酵床菌种提供了切入点。