铝胁迫对杉木幼苗生长、叶片光合特性和叶绿体超微结构的影响1)

叶义全 洪凯 张家君 曹光球 林思祖 杨强 许珊珊

(福建农林大学，福州，350002)

杉木(Cunninghamialanceolata)是我国特有的重要用材树种之一，因其具有干形优美、材性优良和速生丰产等特点，在我国南方林区广泛种植[1-2]。第八次全国森林资源清查结果表明，我国杉木人工林面积约占人工乔木林面积的19.01%，蓄积约占我国人工林蓄积的25.18%，面积和蓄积均居于在我国主要造林树种的首位[3]。因此，对保障我国木材和生态安全具有重要意义。杉木主要分布在我国南方富铁铝化酸性土壤中，大量研究表明铝毒是酸性土壤中影响植物生长，导致人工林产量下降和森林退化的主要原因之一[4-10]。近年来，随着全球酸沉降的加剧和不当施肥的影响，我国土壤酸化面积仍在不断扩大，酸化程度也在不断加深[11-12]。土壤酸化导致其中的活性铝被大量释放，显著增加土壤中铝的含量[13-14]，从而进一步加剧铝对杉木的毒害。因此，在目前我国土壤酸化不断加剧的背景下，如何增强杉木的耐铝能力已成为当前我国林业生产中亟需解决的重大问题。

选育耐铝的杉木优良品系是解决上述问题的重要途径之一，但这是建立在我们对杉木耐铝调控机制了解的基础上。为此，众多学者分别从抗氧化酶活性、养分吸收、叶绿素荧光参数和根系分泌物等不同角度对杉木铝毒展开了大量研究[15-24]，并取得一定成效。这些结果也初步揭示了铝对杉木毒害的作用机理以及抗氧化酶和根系分泌物在调控杉木耐铝性中的关键作用。植物叶片是光合作用的主要部位和铝毒害的关键位点之一，然而目前有关铝对杉木叶片光合特性的影响，特别是从叶绿体超微结构和叶片光合特性角度共同揭示杉木幼苗对铝毒胁迫响应的研究尚未见报道。鉴于此，本研究以杉木实生幼苗为材料，分析铝胁迫下杉木光合气体交换参数、叶绿素荧光特性和叶绿体超微结构的变化规律，以期从光合生理角度揭示铝导致杉木生长受抑的响应机制。

1 材料与方法

1.1 供试材料与培养条件

以福建省尤溪国有林场的三代种子园种子(YX10)为试验材料。将种子用超纯水清洗3遍，接着用0.3%高锰酸钾溶液消毒30 min后，用超纯水清洗干净。随后将种子置于超纯水静置2 h，去掉漂浮在液面的空粒和涩粒。上述处理结束后将种子置于初始温度为45 ℃温水中自然冷却至室温并浸泡至24 h。随后将种子置于含有3 mmol/L的CaCl2溶液的滤纸纸板上萌发；萌发25 d后，将长势一致的杉木幼苗置于10 L的培养框中培养。营养液为改良霍格兰营养液，营养液pH=5.5±0.1。杉木幼苗培养放置于培养室内，培养条件：昼夜循环与温度分别为：光照14 h、25 ℃，黑暗10 h、22 ℃，光合有效辐射110 μmol·m-2·s-1，相对湿度为75%，培养1周后，选取长势基本一致的幼苗进行处理。本试验共设两个处理，分别为对照(CK)和铝处理(Al)，所用铝处理浓度为0.5 mmol·L-1，每处理均设3个重复，每重复21株苗，处理30 d后进行相应指标测定。

1.2 叶绿素荧光参数的测定

1.3 光合作用气体交换参数的测定

光合作用气体交换参数按叶义全等[1]的方法进行。选择在晴天上午(09:00—11:30)进行光合作用气体交换参数测定。试验处理结束时，利用LI-6400便携式光合仪(Li-Cor，Lincolin，USA)对不同处理下杉木幼苗第1轮枝条上的健康成熟叶的光合气体交换参数进行测定，主要包括叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间二氧化碳摩尔分数等指标。测定时选择红蓝光源叶室，叶室温度设定为(25±0.5)℃，CO2摩尔分数为400 μmol·mol-1，叶室流速400 μmol·s-1，光合有效辐射1 000 μmol·m-2·s-1。

1.4 叶绿体超微结构观察

试验处理结束时，分别取对照和铝处理中成熟的杉木叶片组织块各20片。将组织放入2.5%戊二醛-磷酸缓冲液固定6 h后，用0.1 mmol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。接着用2%的锇酸固定液固定2 h,随后再用0.1 mmol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。分别在以下几个不同质量分数梯度的乙醇洗脱液中进行连续脱水处理：体积分数为50%乙醇放置15～20 min、体积分数为70%乙醇放置15～20 min、体积分数为90%乙醇放置15～20 min、体积分数为90%乙醇和体积分数为90%丙酮(1∶1，v/v)放置15～20 min、体积分数为90%丙酮放置15～20 min，以上操作在冰上进行；体积分数为100%丙酮在室温环境下放置15～20 min，3次。处理结束后将样品寄往上海师范大学电镜中心进行后续处理和拍照。

1.5 叶绿素和类胡萝卜素质量分数测定

杉木叶片的叶绿素和类胡萝卜素质量分数测定采用乙醇浸提法。试验处理完成时，选取与测定叶绿素荧光参数统一部位和发育程度一致叶片，用超纯水将叶片清洗干净，然后用吸水纸吸干并剪去叶片主脉。提取时称取0.10 g杉木鲜叶，加入5 mL 95%乙醇充分研磨，随后将研磨液倒入10 mL离心管；接着用3 mL体积分数为95%乙醇清洗研钵，将清洗液倒入10 mL离心管，随后将研磨液置于暗处静置3 h进行提取。提取结束后过滤，并将滤液定容至25 mL容量瓶中，每个处理4个重复。采用分光光度计分别测定提取液664、647和466 mm处的吸光度。根据Arnon[25]公式计算不同处理下杉木叶片中叶绿素和类胡萝卜素的质量分数。

1.6 相对根系伸长测定

将长势和根长基本一致的杉木幼苗分别转移到对照和铝处理溶液中生长30 d。处理结束后分别测定处理前后杉木根系长度，每个处理测21株苗。相对根系伸长为铝处理的根系伸长量相对于对照处理根系伸长量的百分比。

1.7 数据分析

数据分别采用DPS 7.5软件进行方差分析(ANVOA)，平均值间显著性差异采用Duncan’s新复极差法进行检，并用EXCEL进行绘图。

2 结果与分析

2.1 铝对杉木幼苗生长的影响

由表1可知，铝胁迫下杉木根系伸长受到显著抑制，与对照相比，铝胁迫下杉木根长仅为对照的64.04%。此外，铝胁迫下杉木幼苗根系生物量、地上部生物量以及植株生物量也显著低于对照处理，分别较对照下降了48.63%、42.39%和44.03%(表1)。

表1 铝胁迫处理对杉木根系伸长和生物量的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 铝对杉木叶片光合色素质量分数的影响

由图表2可以看出，铝胁迫处理显著降低杉木叶片叶绿素质量分数，铝处理下叶绿素质量分数仅为对照处理的78.55%。类似地，铝胁迫同样降低杉木叶片类胡萝卜素的质量分数，其质量分数较对照下降了21.66%(表2)。可见，铝胁迫处理会抑制叶绿素和类胡萝卜素的合成或促进其降解，导致植株叶片叶绿素和类胡萝卜素质量分数显著降低，进而对植物光合作用产生影响。

表2铝胁迫处理对杉木叶片叶绿素和类胡萝卜素质量分数的影响

处理叶绿素质量分数/mg·g-1类胡萝卜素质量分数/mg·g-1CK(1.96±0.05)a(21.76±0.44)aAl(1.54±0.05)b(17.05±0.64)b

注：表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 铝胁迫对杉木幼苗叶绿素荧光动力学参数的影响

由表3看出，铝胁迫处理增加了杉木叶片初始荧光(Fo)值，但与对照相比不存在显著差异；与对照相比，铝胁迫下Fo增幅为11.60%，这一结果暗示铝胁迫下PSⅡ反应中心可能受到破坏或可逆失活。铝胁迫下杉木叶片最大荧光(Fm)和可变荧光(Fv)都表现出下降趋势，且与各自对照相比均达到显著水平，分别比各自对照降低14.05%和15.69%，表明铝胁迫处理能显著抑制PSⅡ反应中心活性，导致光合电子传递过程受阻。铝胁迫显著降低杉木叶片PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)值，与各自对照相比，铝胁迫下杉木叶片Fv/Fm和Fv/Fo值分别下降2.63%和22.61%，暗示铝胁迫使PSⅡ反应中心受损，降低杉木叶片对光能的转化与利用效率。此外，与对照相比，铝胁迫显著降低杉木PSⅡ实际光化学效率值，表明铝胁迫下杉木叶片光合电子传递速率受到显著抑制。铝胁迫下，杉木叶片光化学淬灭值显著降低，而非光化学淬灭系数显著增加，分别较各自对照下降25%和增加76.92%。上述结果表明铝胁迫显著抑制了光系统PSⅡ电子传递活性与光氧化速率；且由于铝胁迫抑制了植物对光能的利用效率，导致更多的光能通过非光化学淬灭形式耗散，而用于光合碳同化的能量显著降低。综上所述，铝胁迫下杉木生长受抑可能与其叶片具有较低的光能利用效率有关。

表3 铝胁迫处理对杉木叶片叶绿素荧光参数的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.4 铝胁迫对杉木幼苗叶片光合气体交换参数的影响

光合作用是植物进行碳同化，进而促进植物生长的基础。植物叶片是光合的主要部位同时也是铝毒害的主要位点。因此，铝胁迫必然会对植物光合作用产生影响，进而对植物生长产生调控作用。与铝显著抑制杉木生长结果一致(表1)，铝胁迫下杉木叶片净光和速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)显著下降，分别是各自对照的40.56%、40.00%和48.81%(表4)，但铝胁迫处理下杉木叶片胞间CO2摩尔分数(Ci)则显著上升(表4)。上述结果表明，铝胁迫显著抑制杉木叶片光合作用可能是铝抑制杉木生长的主要原因之一。

2.5 铝胁迫对杉木幼苗叶片叶绿体超微结构的影响

透射电镜结果显示，正常条件下叶绿体紧贴细胞壁，具有完整的结构，呈梭形，基粒类囊体片层结构清晰，片层数量较多，排列紧密(图1A、1B)。铝胁迫处理下的叶片细胞结构破坏严重，叶绿体局部膨胀肿起，体积变大，叶绿体内部基质片结构断裂解体，基粒减少，分布不均，且基粒类囊体片层排列不规则，叶绿体细胞整体上呈现紊乱无序的状态(图1C、1D)。此外，与对照相比，铝胁迫处理下未见有淀粉粒存在于叶绿体中(图1)。上述结果表明，铝胁迫导致植物光合效率和光能利用率显著下降，与铝破坏叶绿体超微结构有关。

表4 铝胁迫处理对杉木叶片光合气体交换参数的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Chl.叶绿体Chloroplast；Cw.细胞壁Cell wall；Sg.淀粉粒Starch granule；Gl.基粒片层Grana lamella；Os.嗜锇体颗粒Osmiophilic；A和C白色标尺Bar=2 μm；B和D白色标尺Bar=1 μm。

图1铝对杉木叶片叶绿体超微结构的影响

3 讨论与结论

众所周知，铝胁迫引起的根系伸长受抑是植物遭受铝毒害的典型症状[14]。本试验中铝胁迫处理不但显著抑制杉木根系的伸长，同时对杉木的生长同样具有明显的影响，铝胁迫下杉木单株生物量显著下降，这与前人关于铝胁迫能显著抑制植物生长的结论相一致[26-27]。植株生物量的积累主要来源于叶片光合碳同化过程，因此叶片光合碳同化能力是影响植物生长的关键因素。一般认为，植株光合能力与生长量呈正相关。例如，刘冉等[28]研究表明，盐胁迫显著抑制番茄叶片的光合能力，从而使植株生物量显著降低。马新明等[29]研究发现，随着铅胁迫浓度的升高，烤烟光合速率和产量不断降低。类似地，李淮源等[30]也发现，在高浓度铝胁迫处理下(250和500 μmol·L-1)，烤烟生物量和光合速率均受到显著抑制。本研究显示，杉木幼苗在铝胁迫下，净光合速率、气孔导度及蒸腾速率均显著下降，而胞间二氧化碳摩尔分数则显著升高，进一步证实铝胁迫引起的生物量下降和叶片光合能力呈显著正相关。研究表明，逆境胁迫下气孔性限制和非气孔限制是引起植物光合速率下降的主要因素[31-32]。前人研究指出，如果叶片光合速率下降，但胞间二氧化碳浓度增加，那么非气孔性因素是导致植物光合作用能力下降的主要因素[33]。可见，非气孔性因素是铝胁迫引起的杉木叶片光合速率降低的主要原因，而此时胞间二氧化碳摩尔分数的增加主要由于光合速率的下降，降低叶片对二氧化碳的利用效率，导致细胞内二氧化碳摩尔分数的积累。植物在光合作用过程中对光能的吸收主要通过光合色素实现，如叶绿素和类胡萝卜素等。因此，一般而言植物光合能力的大小与叶绿素和类胡萝卜素含量密切相关[34]。叶绿素是PSⅡ光反应中心的色素分子，在光能吸收和传递中扮演重要角色，而类胡萝卜素除了参与光能吸收外，还作为叶绿体细胞的内源抗氧化剂，在吸收过剩光能，淬灭活性氧保护叶绿体结构完整性中起着十分关键的作用[35]。本试验中，我们发现铝胁迫处理显著降低杉木叶片叶绿素和类胡萝卜素质量分数，暗示铝胁迫可能使光合色素合成受阻或促进其降解，从而抑制杉木叶片对光能的吸收和利用，最终降低植物的光合速率。可见，叶绿素和类胡萝卜素质量分数的下降也是导致铝胁迫下杉木叶片光合速率降低的重要原因之一。值得注意的是，叶绿体超微结构结果表明，铝胁迫下杉木叶绿体局部膨胀肿起，体积变大，叶绿体内部基质片结构断裂解体，基粒减少，分布不均且排列不规则，表明铝胁迫下杉木叶片叶绿体结构遭到严重破坏。此外，铝胁迫还破坏了杉木叶绿体中正常的光合产物积累，进而引起淀粉粒的消失，这与铝胁迫下常绿杨的研究结果一致[36-37]。叶绿体作为光合作用的主要场所，其结构的破坏可能也是导致铝胁迫显著降低杉木叶片光合能力的主要原因之一，该结果与叶绿素和类胡萝卜素质量分数结果相一致，进一步表明铝胁迫下叶绿素和类胡萝卜素质量分数的下降可能主要由于铝促进叶绿体内部结构解体导致的。而铝胁迫下叶绿体内部结构的解体可能由于铝胁迫显著降低了叶片类胡萝卜素的质量分数，进而降低了其对叶绿体中活性氧的清除能力，从而增加叶绿体中活性氧的积累，最终导致叶绿体结构的破坏乃至解体。

叶绿素荧光动力学技术主要用于分析光系统对光能的吸收、传递、耗散和分配情况，能有效地反映出各光合机构的运行情况[38]。初始荧光Fo主要用于表征PSⅡ反应中心的基本状态，其值的大小与PSⅡ天线色素内最初激子密度以及天线色素向PSⅡ反应中心激发能传递速率相关[39]。逆境胁迫下该值的增加通常与PSⅡ反应中心受到不可逆破坏或可逆失活有关。本试验中铝胁迫处理增加了杉木叶片Fo值，暗示铝胁迫下PSⅡ反应中心可能受到破坏或可逆失活，这与理挪等[23]的研究结果一致。Fm和Fv主要分别用于表征光系统PSⅡ的电子传递情况和PSⅡ反应中心活性的高低[40]，铝胁迫下杉木叶片Fm和Fv显著下降，表明铝胁迫处理能显著抑制PSⅡ反应中心活性，导致光合电子传递过程受阻。Fv/Fm主要用于表征光系统PSⅡ的光化学效率，而且该值的大小与植物光合速率密切相关[36]。本研究中杉木叶片在铝胁迫下其Fv/Fm显著下降，这与郑阳霞等[41]在西瓜上的研究结果一致，表明铝胁迫降低叶片光化学效率。此外，铝胁迫处理还显著降低了Fv/Fo值，Fv/Fo主要用于表征PSⅡ的潜在光化学活性，该值越高代表具有活性的反应中心数量越多，能更有效地将光能转化为化学能[40]。因此，铝胁迫下该值的下降，进一步说明铝胁迫下杉木叶片对光能的转化效率显著下降。铝胁迫下F0的增加及Fm、Fv、Fv/Fm和Fv/Fo的下降共同表明，铝胁迫处理导致PSⅡ反应中心受损，降低电子传递速率，阻碍了NADPH和ATP的合成，无法暗反应提供更多的能量，最终导致光合碳同化能力的下降。植物吸收的光能，除了一部分用于光化学反应外，余下的光能主要通过叶绿素荧光和非光化学途径耗散[42]。其中叶绿素荧光耗散途径又可细分为非光化学淬灭和光化学淬灭形式[43]。光化学淬灭与光系统PSⅡ电子传递活性密切相关，而非光化学淬灭则主要反映了植物将多余的光能以热能形式耗散的能力，是逆境胁迫下植物防止过剩光能对光合机构造成破坏的一种重要保护机制[44]。铝胁迫下光化学淬灭值显著降低，而非光化学淬灭系数显著增加，上述结果进一步表明铝胁迫下光系统PSⅡ电子传递活性受到显著抑制，而由于铝胁迫抑制了植物对光能的利用效率，从而导致更多的光能通过非光化学淬灭形式耗散，防止过剩光能对光合结构造成损伤。由于铝胁迫下更多的光能以非光化学淬灭的热能形式耗散，因此用于光合碳同化的光能显著减少，导致叶片对光能的利用效率显著降低，最终影响杉木的生长。

综上所述，铝胁迫引起杉木叶片叶绿体结构严重破坏，进而导致叶片叶绿素和类胡萝卜素质量分数下降，是铝胁迫诱导杉木叶片光合速率和光能利用效率下降的主要原因，而铝胁迫下杉木叶片光合生理响应的这些变化最终导致杉木生长显著受抑。