血瘀证乳腺癌分子分型与EGFR、CK5／6 表达的相关性研究

陈桂芬

（福建中医药大学附属人民医院，福建 福州350004）

表皮生长因子受体 （epithelial growth factor re ceptor，EGFR）是原癌基因c-erbB-1 的表达产物，对维持细胞生长及增殖起关键作用。 EGFR 过度激活会促进乳腺癌细胞增殖、血管生成，促使其转移、抑制其凋亡［1］。 细胞角蛋白5／6（cytokeratin 5／6，CK5／6）是一种高分子量的细胞角蛋白，它主要在上皮细胞基底层中表达，其过度表达与部分恶性肿瘤的发生、发展、转移及预后紧密相关，且被证实可以作为基底细胞样型乳腺癌的特征性标志物［2］。血瘀证是乳腺癌常见的中医辨证分型，现中医“辨病-辨证”诊疗模式越来越受到重视，为此本研究从EGFR、CK5／6 表达的角度出发来讨论其与分子分型的相关性及血瘀证乳腺癌的预后。

1 临床资料

1.1 西医诊断标准 参照《乳腺癌》［3］中乳腺浸润性导管癌的诊断标准。

1.2 中医辨证标准 参照中国中西医结合研究会活血化瘀专业委员会制定的 《血瘀证诊断标准》［4］，由2 位资深的中医师分别进行辨证分型讨论，并达成一致后记录。 血瘀证主要证候：①舌紫、黯，或有瘀斑、瘀点；②脉多呈细涩；③唇及（或）指端多呈紫绀，面部、眼周及（或）唇、齿龈紫黑；④黑便、皮肤瘀斑等；⑤肌肤甲错、皮肤瘀斑等；⑥疼痛（刺痛、久痛、定痛）；⑦经期腹痛，血黑、暗，有血块。 具备其中任意2 项即可诊断为血瘀证，余为非血瘀证者。

1.3 纳入标准 ①均经穿刺或手术病理确诊的原发性乳腺浸润性导管癌；②预计生存期大于6 个月；③卡氏评分［5］超过70 分；④入院前1 个月未服用过活血化瘀等影响中医辨证的中药及中成药。

1.4 排除标准 ①合并有肝脏、肾脏、造血系统及内分泌系统等重大原发性疾病者；②合并有智力障碍，或其他严重精神病不能配合证型评估者。

1.5 一般资料 收集本院2017 年7 月—2019 年3月浸润性乳腺癌患者80 例，于初诊时采集中医望、闻、问、切四诊资料并记录，根据辨证标准分为血瘀证组和非血瘀证组各40 例。血瘀证组年龄（50.25±7.97）岁；淋巴结转移18 例，远处转移1 例。非血瘀证组年龄（52.65±8.28）岁；淋巴结转移17 例，远处转移1 例。 2 组年龄、淋巴结转移情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2 方 法

2 组均进行穿刺或手术取得人体乳腺癌组织病理。采用免疫组化EnVision 二步法测定人体乳腺组织雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterong receptor，PR）、人类表皮因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、增殖细胞核抗原（Ki-67）、EGFR、CK5／6 的阴性和阳性表达情况，根据ER、PR、HER-2、Ki-67 表达情况进行乳腺癌分子分型。 留取部分新鲜的乳腺癌组织标本置于-80 ℃冰箱保存， 采用实时定量PCR（RT-PCR）检测EGFR、CK5／6 的基因表达。

2.1 免疫组化EnVision 二步法测定蛋白表达 采用免疫组化EnVision 二步法测定ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR、CK5／6 的表达。用PBS 缓冲液将脱蜡至水后的组织切片冲洗，热抗原修复后在室温下自然冷却取出，加3%过氧化氢溶液，避光孵育，滴加一抗，放置4 ℃冰箱中过夜，第二天取出在室温下复温30 min，滴加显色剂，显微镜下控制显色，显色完全后，用水冲洗终止显色，脱水，封片。 以上石蜡切片由我院病理科资深的技术人员制片，使用统一试剂和抗体，并由我院病理科资深医师读片。

2.2 阴性和阳性表达判断标准 ①ER、PR：阳性细胞的数量≥1%为阳性（+），余为阴性（-）；②Ki-67：阳性细胞数≤5%为阴性（-），余为阳性（+）；③HER-2：不着色为阴性（-），着色为阳性（+），必要时行FISH 检测；④EGFR：细胞不着色为阴性（-），着色细胞数＜25%为弱阳性（+），25%～50%为阳性（++），50%以上为强阳性（+++），EGFR 阳性包括弱阳性、阳性、强阳性；⑤CK5／6：细胞着色数量＜5%为阴性（-），5%～24%为弱阳性（+），25%～50%为阳性（++），50%以上为强阳性（+++），CK5／6 阳性包括弱阳性、阳性、强阳性。

2.3 乳腺癌分子分型 参照《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南，2013 版》分型标准进行分子分型［6］。①Luminal A 型：ER（+）／PR（+），且PR 表达≥20%，HER-2（-），Ki-67≤14%；②Luminal B 型：ER（+）／PR（+），HER-2（-），且Ki-67＞14%或PR＜20%；ER（+）／PR（+），HER-2（+），任何状态的Ki-67；③HER-2 过表达型：ER（-）和PR（-）且HER-2（+）；④基底细胞样型：ER（-），PR（-）且HER-2（-）。

2.4 RT-PCR 法检测乳腺癌组织EGFR、CK5／6 mRNA 表达 用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 合成cDNA 第一链，RT 反应液在冰上配制，经过42 ℃、30 min 的反转录反应，及85 ℃、5 min 的反转录酶失活反应，得到的cDNA 放置在-20 ℃冰箱中备用，或者立即用于PCR反应。 用Primer Premier 5.0 设计内参基因和目标基因的特异性引物，用Oligo 6.0 检验其特异性。GAPDH：F 5'-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3'（131 bp），R 5'-AGTAGAGGCAGGGATGATGTT-3'；EGFR：F 5'-GATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCC-3'（1 048 bp），R 5'-GGATGT TATGTTCAGGCTGACGACT-3'；CK5／6：F 5'-CTCAAGGATGCCAGGAACAAG-3'（248 bp），R 5'-CCACTGCCACTGCCATATC-3'。 反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游 引 物0.8 μL，cDNA 模 板1 μL，dd H2O 加 至20 μL。 经94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，反应后进行琼脂糖凝胶电脉PCR 检测。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行资料分析。计数资料用χ2检验；非正态分布，采用秩和检验（独立样本Mann-Whitney U 检验）。

3 结 果

3.1 2 组EGFR、CK5／6 蛋白表达情况比较 血瘀证组乳腺组织EGFR 阳性例数明显高于非血瘀证组（χ2＝6.146，P＝0.013）；血瘀证组乳腺组织CK5／6阳性例数与非血瘀证组比较差异无统计学意义（χ2＝3.660，P＝0.056），见表1。

表1 2 组EGFR、CK5／6 蛋白表达情况比较

3.2 分子分型与EGFR、CK5／6 表达的相关性EGFR 表达情况：Luminal A 型、Luminal B、HER-2过表达型、基底细胞样型在阳性率上逐渐升高，可认为EGFR 表达与分子分型之间呈正相关（r＝1.00，P＝0.000）；CK5／6 表达情况：CK5／6 表达与分子分型无相关（r＝0.800，P＝0.200）。CK5／6 在基底细胞样型乳腺癌的阳性表达率显著高于其他3 型。 见表2。

表2 免疫组化法分子分型与EGFR、CK5／6 表达的相关性

3.3 2 组乳腺组织EGFR、CK5／6 mRNA 表达比较见表3。

3.4 EGFR、CK5／6 mRNA 表达与分子分型的相关性 对80 例患者的分子分型（Luminal A、Luminal B、HER-2 过表达型、基底细胞样型）与EGFR、CK5／6 mRNA 表达情况进行相关性分析，结果均呈直线正相关（EGFR：r＝0.726，P＝0.000；CK5／6：r＝0.550，P＝0.000）；EGFR、CK5／6 的表达也呈正相关（r＝0.562，P＝0.000）。

表3 2 组乳腺组织EGFR、CK5／6 mRNA 表达比较（x±s）

4 讨 论

EGFR 是原癌基因c-erbB-1 的表达产物，其高表达在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用［7-8］。EGFR 过度表达可导致恶性肿瘤病患复发率高，存活期短［9-11］。目前已有不少研究证实癌组织中EGFR 表 达 与 预 后 紧 密 相 关［12］，Kallel 等［13］研 究 也发现，据临床实验生存分析显示EGFR 表达与生存显著相关，可指导乳腺癌患者的预后。EGFR 的表达随着乳腺癌恶性程度的增高、分期增加、分化越差而增强［14-15］，故EGFR 对乳腺癌预后具有较高的指导价值。 目前越来越多的研究证实CK5／6 可用于指导乳腺癌患者的预后［16］。 Sutton 等［17］也发现CK5／6的表达与乳腺癌转移有明显的相关性，提示预后较差。

血瘀证是因瘀血内阻而产生的证候，其在乳腺癌形成过程中占有十分重要的地位。唐容川谓：“离经之血便是瘀。 ”瘀血聚集成块，阻塞脉络，消耗人体正气，导致机体抗邪之力明显下降，从而使癌细胞迅速增殖、扩散。 现代医学认为恶性肿瘤中血瘀证患者体内血液普遍呈高凝状态，致使血流缓慢，癌栓形成，从而加速癌细胞的转移，影响患者预后［18］。本研究结果显示，血瘀证乳腺癌分布于HER-2 过表达型和基底细胞样型的例数总和较Luminal 型多，ER 值及PR 值平均秩均较低，提示预后可能较差，而非血瘀证乳腺癌组分布主要倾向于Luminal 型，预后相对较好。

本研究结果显示：血瘀证乳腺癌组中，EGFR 蛋白和mRNA 表达明显高于非血瘀证组（P＜0.05）；CK5／6 mRNA 表达明显高于非血瘀证组（P＜0.05），但蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。 由此仍可提示，血瘀证乳腺癌患者的预后较非血瘀证者差。

乳腺癌分子分型可分为Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 过表达型及基底细胞样型，根据以上分型顺序，预后依次变差。 本研究中：EGFR 表达阳性率与分子分型呈正相关（P＜0.05），分型越差，阳性率越高；CK5／6 表达阳性率与分子分型无相关。CK5／6 在基底细胞样型乳腺癌中阳性率显著高于其他三型，在Luminal B 型表达的阳性率比HER-2 过表达型稍高，表明CK5／6 可作为基底细胞样型乳腺癌的标志物。分子分型与EGFR、CK5／6 的表达情况呈直线正相关（P＜0.05），分型越差，EGFR、CK5／6 的灰度值越高；EGFR、CK5／6 的表达也呈正相关（P＜0.05）。 综上所述，分子分型与EGFR 的表达呈正相关，而CK5／6 却存在分歧，这可能和样本量较少及免疫组化敏感性欠稳定有关，今后将继续追加样本量，尽可能排除外界干扰因素，以继续进一步研究探讨。