碘乙酸致大鼠膝骨关节炎疼痛模型的实验研究

周 康 叶妙勇 马 轲 单乐天

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种复杂的多病因退变性关节疾病[1-3]。其典型特征是关节软骨退变，软骨降解、关节局部炎症、软骨下骨硬化、韧带和关节腔退变等一系列退行性病变，最终引起关节疼痛、僵硬、失用等行为功能障碍[4-6]。目前临床尚无满意的治疗方法，而疾病晚期外科手术是唯一的治疗手段。因此，早期进行OA 防治尤其重要。但获取足量适合研究的早期OA 人类骨标本较为困难。因此，动物模型在研究早期OA 病程变化中起到重要作用。关节疼痛、僵硬是OA 的主要症状，通过建立关节疼痛动物模型是研究OA 病理机制、治疗及预防的必要手段，而现有的OA 动物模型并不能反映关节疼痛的变化，通过动物关节腔注射碘乙酸溶液是目前最适合研究疼痛OA 模型最合适的方法[7]。但是目前尚无统一的碘乙酸模型的剂量标准[8-10]。本实验通过大鼠膝关节腔内注射不同浓度碘乙酸溶液，探究碘乙酸致大鼠OA 的浓度及时间规律。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级雄性SD 大鼠72 只，体质量为（200±10）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]，并由浙江中医药大学实验动物中心[SYXK（浙）2018-0012]饲养。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料及自由饮水，控制温度（23±2）℃和湿度60%，12h 循环灯光。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》，所有操作均符合实验动物伦理学要求（伦理审批号：IACUC-20190909-26）。

1.2 试 剂 生理盐水（杭州润泽科学器材有限公司，规格：2.5mL）、碘乙酸（上海联硕生物科技有限公司，规格：25g，批号64-69-7）；4%多聚甲醛（杭州诺森德生物技术有限公司，规格：500mL，批号BL539A）、EDTA 脱钙液（杭州禾惠化工有限公司，规格：500mL，批号R20403-500mL）、水合氯醛（上海化学试剂采购供应五联化工厂，规格：250g，批号302-17-0）。

1.3 仪 器 微量注射器：（Hamilton，US，型号：Model 710 N SYR）、电子机械痛仪（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司，型号：YLS－3E），足底热辐射测痛仪（UGO BASILE，Italy，型号：37370）、大鼠抓力仪（北京冀诺泰科技发展有限公司，型号：ZS000012）、荧光倒置显微镜（ZEISS，Germany，型号：AXiovert200）。

2 实验方法

2.1 动物分组及造模 72 只SD 大鼠适应性饲养1周后按照随机数字表法分为对照组及碘乙酸低、中、高浓度组，各18 只。将实验动物用10%的水合氯醛溶液以0.3mL/100g 的剂量腹腔注射实施麻醉后，膝关节脱毛、消毒。一手使膝关节屈曲90°，另一手触摸找出股骨髁、髌骨及髌韧带。微量注射器针头紧靠髌韧带两侧髌骨下方对准股骨髁方向进针，当感到明显的落空感时即已进入关节腔内。对照组双侧膝关节各注射50μL 生理盐水，碘乙酸低、中、高浓度组大鼠每侧膝关节分别注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超纯水配置）50μL[11-12]。操作完成待大鼠苏醒后放回笼内饲养。

2.2 一般形态观察及取材 造模后第1、7、14、21、28、35 天后观察大鼠一般情况，测量热痛值、机械痛值。每次测量后碘乙酸低、中、高浓度组各随机处死3只大鼠，处死后截断双侧胫骨、股骨中部，取一侧膝关节进行常规组织石蜡切片、SO 染色，显微镜下观察软骨组织学特征，另一侧膝关节取股骨，去除关节周围软组织，充分显露关节面并观察比较关节面组织形态学表现变化。

2.3 机械痛值测量 模型建立后1、7、14、21、28、35天测量机械痛值。将大鼠足背置于电子机械痛仪的扁型压头下，开始施压，当动物因疼痛出现嘶鸣或挣扎时停止施压，此时显示屏上显示的克数即为该大鼠的机械痛阈值。每测完1 次机械痛后让大鼠镇静5min，测3 次取平均值。

2.4 热痛值测量 模型建立后1、7、14、21、28、35 天机械痛测定后5h 测定热痛值。将大鼠置于足底热辐射测痛仪玻璃板上的透明有机玻璃箱内，待大鼠安静后（即停止梳理毛发和探索性活动，约15min），将测试仪上的“十”字形标记置于大鼠后足底中央并避开足垫，测试计时，待大鼠抬足，计时自动停止，记录时间。把光热开始照射大鼠足底到抽脚反应的潜伏期定为伤害性感受阈。取前后（间隔5min）3 次测量的平均值作为测量值。为防止大鼠热辐射烫伤，将大鼠热痛阈值测定时间上限值设定为20s，温度上限值设定为35℃[13]。

2.5 大体及病理观察 每次测量后每组随机处死3只大鼠，处死后截断一侧胫骨、股骨中部，取膝关节置于4%甲醛溶液中固定48h，EDTA 脱钙4 周，酒精逐级脱水，浸蜡包埋后在切片机上沿膝关节矢状面将胫骨外侧平台软骨下松质骨和股骨外侧髁软骨下松质骨均沿下肢纵轴方向作切片，厚度5μm，常规SO 染色、封片，置光镜下对其组织结构进行详细的观察并参照Mankin 关节软骨病理评分标准进行积分统计[14]。Mankin 评分标准[15]：正常0 分，表面不规则1 分，血管翳2 分，血管翳和表面不规则3 分，到过渡带的裂隙4 分，到放射带的裂隙5 分，到钙化带的裂隙6 分；细胞评分：正常0 分，弥漫性细胞过多1分，局部细胞增多2 分，细胞过少分；基质染色：正常0 分，轻度减少1 分，中度减少2 分，重度减少3 分，未着色4 分；潮线完整性：完整0 分，被血管破坏1分；总分14 分。另一侧去除关节周围软组织，充分显示股骨关节面，观察比较关节面的光泽及完整度。

2.6 统计学方法 应用DPS 9.5 软件进行数据统计分析，四组大鼠机械痛值及热刺激痛值测量结果以均数±标准差（）表示，组间整体比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况比较 所有大鼠于造模结束麻醉苏醒后均能自由活动下肢，而在造模后第2 天，碘乙酸高浓度组大鼠出现膝关节僵直肿胀，无法自由活动（见插页图1）。碘乙酸低、中、高浓度组大鼠造模后7 天内少动，精神较正常组稍差。造模后碘乙酸低、中、高浓度组大鼠体质量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

3.2 各组大鼠机械痛阈值比较 对照组大鼠机械痛值较为稳定，仅有小幅度波动，没有疼痛反应。造模后，碘乙酸低、中、高浓度组大鼠机械痛阈值即开始下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；而且碘乙酸中浓度组大鼠机械痛阈值低于低浓度组，高浓度组大鼠机械痛阈值低于低、中浓度组（P＜0.05 或P＜0.01）；且在造模第21 天，碘乙酸中、低浓度组机械痛阈值均低于同组其他时间点（P＜0.05）；碘乙酸高浓度组在造模14 天，机械痛阈值均低于该组其他时间点（P＜0.05）。见表2。

3.3 各组大鼠热刺激痛阈值比较 造模后，碘乙酸低、中、高浓度组大鼠热刺激痛阈值均低于对照组（P＜0.01）；第7、21、28 天，碘乙酸中浓度组大鼠热刺激痛阈值均低于低浓度组（P＜0.05）；第14、28、35天，碘乙酸高浓度组大鼠热刺激痛阈值低于中浓度组（P＜0.05）；第7、14、21、28 天，碘乙酸高浓度组大鼠热刺激痛阈值低于低浓度组（P＜0.05）。碘乙酸低浓度组28 天和35 天热刺激痛阈值低于21 天，中浓度组第21 天及28 天热刺激痛阈值低于第14 天及35 天，高浓度组第28 天热刺激痛阈值低于第21 天及35 天（P＜0.05）。见表3。

3.4 各组大鼠病理切片比较 对照组大鼠膝关节软骨切片表面光滑平整，软骨细胞分布均匀，排列整齐，偶有软骨细胞肥大，各层次清晰，无明显细胞簇集现象，潮线完整，潮线下骨小梁无断裂减少。与对照组相比，碘乙酸各浓度组大鼠膝关节软骨面均有不同程度缺损，低浓度组表层软骨细胞局部缺失、各层软骨细胞排列尚可，移行层出现少量软骨细胞簇，软骨下骨小梁尚完整。碘乙酸中、高浓度组局部染色不均匀。碘乙酸中浓度组软骨细胞明显减少、排列紊乱，软骨底层可见大量肥大的软骨细胞；关节软骨破坏至软骨下骨，软骨下骨硬化，骨小梁面积明显减小，骨髓腔细胞增生、排列紊乱，骨小梁中的骨细胞明显减少。碘乙酸高浓度组软骨层破坏严重，软骨表面多处缺损，凹凸不平，软骨细胞数目减少，细胞簇集现象明显，移行层可见较多肥大的软骨细胞，关节破坏区表层覆盖大量的纤维素，潮线模糊断裂，骨小梁中仅存少量软骨细胞，见插页图2。

表1 各组大鼠体质量变化（g，）

注：对照组双侧膝关节各注射50μL 生理盐水；碘乙酸低、中、高浓度组大鼠每侧膝关节分别注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超纯水配置）50μL；n 为各组大鼠数

表2 各组大鼠机械痛阈值比较（g，）

注：对照组双侧膝关节各注射50μL 生理盐水；碘乙酸低、中、高浓度组大鼠每侧膝关节分别注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超纯水配置）50μL；n 为各组测量的鼠足数量；与对照组同期比较，aP＜0.01；与碘乙酸低浓度组同期比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与碘乙酸中浓度组同期比较，cP＜0.05；与同组其他时间点比较，dP＜0.05

表3 各组大鼠热刺激痛阈值比较（s，）

表3 各组大鼠热刺激痛阈值比较（s，）

注：对照组双侧膝关节各注射50μL 生理盐水；碘乙酸低、中、高浓度组大鼠每侧膝关节分别注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超纯水配置）50μL；n 为各组测量的鼠足数量；与对照组同期比较，aP＜0.01；与低浓度组同期比较，bP＜0.05；与中浓度组同期比较，cP＜0.05；与碘乙酸低浓度组第21 天比较，dP＜0.05；与碘乙酸中浓度组第14 及35 天比较，eP＜0.05；与碘乙酸高浓度组第21 及35 天比较，fP＜0.05

图1 高浓度组大鼠一般情况

图2 各组大鼠膝关节软骨组织切片（SO 染色×50）

3.5 各组大鼠Mankin 评分比较 与对照组比较，碘乙酸低、中、高浓度组大鼠膝关节软骨组织Mankin评分显著增高（P＜0.01）；且碘乙酸高浓度组大鼠膝关节软骨组织Mankin 评分高于低、中浓度组，中浓度组高于低浓度组（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠膝关节软骨组织切片Mankin 评分比较（分，）

表4 各组大鼠膝关节软骨组织切片Mankin 评分比较（分，）

注：对照组双侧膝关节各注射50μL 生理盐水；碘乙酸低、中、高浓度组大鼠每侧膝关节分别注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超纯水配置）50μL；与对照组比较，aP＜0.01；与碘乙酸低浓度组比较，bP＜0.05；与碘乙酸中浓度组比较，cP＜0.05

4 讨论

通过膝关节注射碘乙酸建立大鼠OA 模型是一种简单、快捷、成模率高、病理表现与人骨性关节炎相似的方法，而且能够造成大鼠关节疼痛，便于对模型的评估，同时也能够模拟OA 临床的关节疼痛表现，为临床研究提供有利条件[16]。然而现在对于通过大鼠膝关节注射碘乙酸建立OA 模型尚无统一剂量标准[8-10]。

实验结果表明，通过大鼠膝关节注射碘乙酸溶液后能够建立典型的OA 模型，引起明显的疼痛，且具有剂量和时间效应，随着注射碘乙酸浓度的增加，大鼠膝关节的损伤更为严重，表现为机械痛、热痛阈值的下降，软骨损伤更加严重，在造模后21～28 天损伤最为严重。这是由于碘乙酸有破坏关节软骨和周围滑膜韧带的作用，将其注入关节腔内，能改变关节腔原有的稳态，还可引起关节内炎症反应，从而改变软骨和软骨下骨的新陈代谢，破坏关节内环境的稳定，使软骨细胞凋亡、软骨磨损。同时造成关节内其他结构的损伤，关节周围组织增生形成骨赘，最终发展为OA，而在造模后35 天，从机械痛阈值与热痛阈值上反映，大鼠的疼痛有所改善，这可能与膝关节软骨细胞的自我修复有关，但其具体机制仍有待进一步探究[17-18]。