雷公藤甲素通过调控Toll-样受体（TLR）/核因子κB（NF-κB）信号通路对糖尿病肾病模型小鼠足细胞的作用研究

任凌燕 朱 鸣 朱华艳 丁 敏 费丹峰 霍丽霞 王霄一

糖尿病能够诱发足细胞损伤，使足细胞形态和细胞连接间隙发生改变，最终导致蛋白尿和糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）形成[1]。因此，DN 在一定意义上被认为是一种“足细胞疾病”。雷公藤甲素能够减轻DN 足细胞损伤，改善肾小球滤过膜通透性，降低尿蛋白，改善血浆白蛋白水平，起到保护患者肾功能的作用[2]。Toll-样受体4（TLR4）和核因子κB（NF-κB）作为炎症反应胁迫的重要调节剂，其表达水平的升级或过度激活可能是导致糖尿病肾脏损伤的重要机制之一[3]。本实验应用9 周龄db/db 小鼠为研究对象，以TLR/NF-κB 信号通路和足细胞损伤为重要切入点，观察雷公藤甲素治疗DN 的疗效，探索其防治DN 的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 9 周龄健康雄性BKS-db/db 小鼠18 只，体质量（38.25±1.42）g，9 周龄BKS-db/m 对照小鼠6 只，体质量（20.10±1.50）g，均购于南京大学模式动物研究所，实验动物许可证号：SYXK（苏）2015-0001，动物伦理批件号：IACUC-20190729-09，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，温度24～28℃，湿度75%左右，适应SPF 环境1 周，自由摄食基础饲料。

1.2 药物与试剂 雷公藤甲素（批号ST8290）购自北京索莱宝科技有限公司，高效液相色谱测试表明，药物纯度在99%以上，用少量二甲基亚砜将药物完全溶解，然后用生理盐水配制相应浓度（5μg/mL）。替米沙坦（批号ST9190）购自北京索莱宝科技有限公司，用生理盐水配制相应浓度（0.5mg/mL）。小鼠尿微量白蛋白酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（批号E038）、血清白蛋白（批号A028-1）、血糖（批号BC1875）、血清肌酐（批号BC1875）、血清总胆固醇（批号A111-1）、血清三酰甘油（批号F001）均购自南京建成生物科技有限公司。Nephrin 抗体（批号ab216341）、Podocin 抗体（批号ab50339）、TLR4 抗体（批 号ab13556）和NF-κB（p65）抗 体（批 号ab246347）均购自英国Abcam 公司。通用免疫组化染色试剂盒（批号ZLI908）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。总蛋白提取试剂盒（批号WB-0072）、BCA蛋白定量试剂盒（批号BCA02）、内参GAPDH（批号GA-003R）、蛋白Marker（批号PM-0011）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批号WB-0131）均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 实验分组 9 周龄BKS-db/m 小鼠6 只为正常对照组，18 只9 周龄BKS-db/db 小鼠按照随机数字表法分为DN 对照组、替米沙坦组及雷公藤甲素组，各6 只。各组小鼠自由进食、进水，保持垫料干燥，12h明暗交替照明。

2.2 给 药 替米沙坦组予替米沙坦悬液（5mg/kg）灌胃，1 天1 次；雷公藤甲素组予雷公藤甲素悬液（50μg/kg）灌胃，1 天1 次；正常对照组和DN 对照组给予等量0.9%生理盐水灌胃，1 天1 次，持续给药8 周。

2.3 24h 尿蛋白定量检测 给药后第8 周，使用小鼠代谢笼收集各组小鼠24h 尿液并记录尿量，低速低温离心机（SIGMA，德国）中2500r/min×3min 离心，离心半径13.5cm，去除沉渣。按试剂盒检测说明采用ELISA 法进行尿白蛋白测定。

2.4 血生化指标检测及肾组织取材 给药后第8周，小鼠处理前称重，心脏取血，分离血浆，-20℃保存，使用HITACHI7080 全自动生化分析仪进行血清白蛋白、血糖、肌酐、总胆固醇、三酰甘油测定。剥离双侧肾脏，用滤纸吸干双肾表面血液后称重，计算肾脏指数[肾脏指数=左肾质量（g）/体质量（g）×100%]。右肾1/2 保存于福尔马林溶液中用于石蜡包埋，剩余右肾1/2 与左肾液氮冷冻后保存于-80℃冰箱用于蛋白印迹法（Western blot）检测。

2.5 免疫组化法（IHC）检测小鼠肾脏WT1 蛋白表达并计数足细胞数量 取各组小鼠左侧肾脏石蜡切片标本脱蜡、脱水，抗原暴露，先后滴加一抗（WT1 1:200），二抗（1:5000），DAB 显色后脱水、透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察各组小鼠肾脏WT1 表达并取图。采用disector/fractionator 方法计数各组小鼠的足细胞数量[4]。

2.6 Western blot 检测小鼠肾组织Nephrin、Podocin、TLR4 及NF-κB 表达 称取各组小鼠左肾脏组织50mg 于4mL 离心管中，加入细胞裂解液、蛋白酶抑制剂等使之充分混合后，冰浴20min，低温离心5min，收集上清液，加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白转至PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭并行一抗Nephrin（稀释度1:500）、Podocin（稀释度1:2000）、TLR4（稀释度1:500）、NF-κB（稀释度1:1000）、GAPDH（稀释度1:10000）进行孵育，在4℃过夜，用Tris 缓冲盐溶液洗涤膜，加入第二抗体（稀释度1:2000）孵育并洗涤膜。用高灵敏度化学发光试剂（ECL）研制该膜，并用凝胶成像分析系统对该带进行分析。以GAPDH 为内参照，获得目标蛋白的相对表达。

2.7 肾脏组织病理学改变 将取好的各组小鼠右肾1/2 组织用体积分数10%的甲醛溶液固定肾组织，常规石蜡包埋，2μm 厚切片，行过碘酸雪夫反应染色（PAS），观察肾脏组织病理学变化情况。

2.8 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件，计量资料均进行正态分布和方差齐性检验，计量资料以均数±标准差（）表示，方差齐性时多组间比较采用单因素方差分析；方差不齐性时采用Brown-Forsythe 分析。非正态分布的计量资料采用Kruskal-Wallis H 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠一般情况比较 与正常对照组比较，DN 对照组、替米沙坦组及雷公藤甲素组小鼠逐渐出现精神萎靡、毛色不顺滑、多饮、多食、多尿以及消瘦等症状，且DN 对照组小鼠症状更典型。

3.2 各组小鼠24h 尿蛋白定量、体质量及肾脏指数变化 实验第8 周，DN 对照组小鼠24h 尿蛋白定量较正常对照组明显增加（P＜0.01），替米沙坦组和雷公藤甲素组较DN 对照组24h 尿蛋白定量明显下降（P 均＜0.01），替米沙坦组与雷公藤甲素组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。肉眼可见DN 对照组、替米沙坦组、雷公藤甲素组小鼠肾脏体积明显增大，质地柔软，肾脏周围有大量脂肪包绕，剖面皮质肿胀且苍白，髓质呈现暗红色。DN 对照组小鼠体质量、肾脏指数较正常对照组小鼠明显增加（P 均＜0.01），替米沙坦组、雷公藤甲素组较DN 对照组肾脏指数明显下降（P 均＜0.01），见表1。

表1 各组小鼠24h 尿蛋白定量、体质量及肾脏指数比较（）

表1 各组小鼠24h 尿蛋白定量、体质量及肾脏指数比较（）

注：正常对照组及DN 对照组予等量0.9%生理盐水灌胃；替米沙坦组予替米沙坦悬液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素组予雷公藤甲素悬液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 为糖尿病肾病；与正常对照组比较，aP＜0.01；与DN 对照组比较，bP＜0.01

3.3 各组小鼠血生化指标比较 实验第8 周，与正常对照组比较，DN 对照组小鼠血糖、血清肌酐、总胆固醇及三酰甘油水平明显升高（P 均＜0.01），血清白蛋白明显下降（P＜0.01）。与DN 对照组比较，雷公藤甲素组血清肌酐、总胆固醇及三酰甘油水平明显下降（P 均＜0.01），血清白蛋白水平明显升高（P＜0.01），但雷公藤甲素组与替米沙坦组疗效基本相当（P 均＞0.05）。雷公藤甲素组、替米沙坦组小鼠血糖水平与DN 对照组小鼠比较，差异无统计学意义（P 均＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠血生化指标比较（）

表2 各组小鼠血生化指标比较（）

注：正常对照组及DN 对照组予等量0.9%生理盐水灌胃；替米沙坦组予替米沙坦悬液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素组予雷公藤甲素悬液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 为糖尿病肾病；与正常对照组比较，aP＜0.01；与DN 对照组比较，bP＜0.01

3.4 各组小鼠肾脏病理改变 DN 对照组小鼠肾小球体积明显增大，细胞数量增加，系膜基质扩张，毛细血管壁增厚以及足细胞增生和肥大。替米沙坦组和雷公藤甲素组，肾小球体积较DN 对照组小鼠明显缩小（见插页图1）。DN 对照组小鼠足细胞计数较正常对照组小鼠明显下降（P＜0.01），替米沙坦组和雷公藤甲素组足细胞数量较DN 对照组明显上升（P＜0.01），雷公藤甲素组优于替米沙坦组（P＜0.05），见表3。

图1 各组小鼠肾脏病理改变（PAS×400，IHC×400）

表3 各组小鼠足细胞计数比较（个/肾小球，）

表3 各组小鼠足细胞计数比较（个/肾小球，）

注：正常对照组及DN 对照组予等量0.9%生理盐水灌胃；替米沙坦组予替米沙坦悬液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素组予雷公藤甲素悬液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 为糖尿病肾病；与正常对照组比较，aP＜0.01；与DN 对照组比较，bP＜0.01；与替米沙坦组比较，cP＜0.05

3.5 各组小鼠肾组织Nephrin、Podocin、TLR4、NFκB 蛋白表达比较 实验第8 周，DN 对照组小鼠足细胞相关分子Nephrin、Podocin 蛋白表达量较正常对照组明显下降（P 均＜0.01），替米沙坦组与雷公藤甲素组较DN 对照组明显上升（P 均＜0.01），且雷公藤甲素组优于替米沙坦组（P 均＜0.05）。DN 对照组小鼠TLR4、NF-κB 蛋白表达量较正常对照组明显上升（P 均＜0.01），替米沙坦组与雷公藤甲素组较DN 对照组明显下降（P 均＜0.01），替米沙坦与雷公藤甲素疗效无差别（P 均＞0.05），见表4、图1。

表4 各组小鼠肾组织Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB蛋白表达量比较（）

表4 各组小鼠肾组织Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB蛋白表达量比较（）

注：正常对照组及DN 对照组予等量0.9%生理盐水灌胃；替米沙坦组予替米沙坦悬液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素组予雷公藤甲素悬液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 为糖尿病肾病；Nephrin 为肾病蛋白；Podocin为足突蛋白；TLR4 为Toll-样受体4；NF-κB 为核因子κB；与正常对照组比较，aP＜0.01；与DN 对照组比较，bP＜0.01；与替米沙坦组比较，cP＜0.05

图1 各组小鼠肾组织Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB 的Western blot 结果

4 讨论

DN 是终末期肾脏疾病最常见的微血管并发症，15%～25%I 型糖尿病患者和30%～40%II 型糖尿病患者均会受到影响[5]。研究证实，炎症和免疫因素是DN的重要发病机制之一[6]。足细胞损伤在DN 发病机制中扮演重要角色，DN 早期就伴随有足细胞结构与功能的变化以及数量的减少[7-8]。

雷公藤甲素的抗炎与免疫抑制作用早已得到证实[9]。雷公藤甲素能够上调足细胞重要分子Nephrin、Podocin 的表达及调整其分布，减轻足细胞损伤，降低蛋白尿[10]。本实验结果显示，雷公藤甲素可以显著降低DN 模型小鼠蛋白尿，其效果与替米沙坦片基本相同（P＞0.05）。既往研究表明，高脂血症对肾脏系膜细胞、足细胞有毒害作用[11]。本实验发现雷公藤甲素能够升高DN 模型小鼠血白蛋白，降低其肌酐、总胆固醇及三酰甘油水平（P 均＜0.01），说明雷公藤甲素能够改善脂质代谢紊乱，保护肾功能。DN 模型小鼠足细胞重要分子Nephrin、Podocin 蛋白水平以及足细胞数量明显下降（P 均＜0.01），雷公藤甲素能够明显提高Nephrin、Podocin 蛋白水平以及降低足细胞数量（P 均＜0.01）。以上结果进一步证明，雷公藤甲素可能通过保护肾脏足细胞使蛋白尿、脂质代谢紊乱减轻，进而保护肾功能。

炎症介质在DN 发生、发展中起到重要的作用，表现为促炎症介质和趋化因子的增加[6]。现有研究提示，炎性因子介导的信号通路的激活有可能会造成细胞的损伤，TLR-NF-κB（Toll-like receptors and Nuclear factor-kappaB）信号通路就是其中的一条通路[12]。不同的Toll 样受体（TLRs）在与相应的配体结合后，活化核转录因子NF-κB，进而导致促炎性细胞因子和趋化因子增加，最终引起炎症反应[13-14]。据报道，在所有TLRs 中，TLR4 与急性肾损伤，慢性肾脏病和DN 的发生关系最密切[15-16]。NF-κB 的激活促进了DN 炎症反应及肾脏纤维化[3]。已经证明，TLR4/NFκB 通路的促炎症作用与糖尿病相关并发症的发展有关[17]。但是足细胞损伤和耗竭的机制以及足细胞是否促进DN 肾小球炎症反应尚未明确。实验证实，暴露于高糖的足细胞和肾小管上皮细胞会促进TLR4的激活，从而导致NF-κB 活化以及随之而来的炎症和纤维化反应[18]。同时，NF-κB 的活化也能够明显促进高糖诱导的足细胞进一步损伤以及TLR4 的表达增加[19]。以上证据表明TLR4/NF-κB 通路参与DN 足细胞损伤过程。本研究显示，DN 模型小鼠足细胞重要分子Nephrin、Podocin 蛋白水平明显下降（P 均<0.01），TLR4、NF-κB 蛋白表达量明显上升（P 均<0.01），经雷公藤甲素治疗后，Nephrin、Podocin 蛋白表达量明显上升（P 均<0.01），TLR4、NF-κB 蛋白表达量明显下降（P 均<0.01）。肾脏病理也证实了雷公藤甲素能够明显改善DN 肾脏病变情况。本研究无法确定TLR4、NF-κB 在导致DN 足细胞损伤中占有主导地位，但提示TLR4、NF-κB 在足细胞损伤中占有重要作用。

综上所述，雷公藤甲素可能通过抑制TLR4/NFκB 通路减轻炎症反应和足细胞损伤从而改善DN。