米糠蛋白的超声改性及在亚麻籽油微胶囊中的应用研究

2020-03-23常慧敏田少君丁芳芳

河南工业大学学报（自然科学版） 2020年1期

常慧敏，田少君，丁芳芳

河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450001

亚麻籽油富含ω-3必需脂肪酸，具有预防冠心病、癌症、神经和激素紊乱等功能[1]，但是其氧化稳定性差，采用喷雾干燥法将亚麻籽油制成微胶囊是避免脂质酸败的有效方法。碳水化合物如麦芽糊精、阿拉伯树胶等具有溶解性好、高浓度下黏度低等特性，是制备微胶囊的常用壁材，但其乳化性能较差，不能较好地包埋疏水性芯材。多糖与蛋白质结合，具有良好的乳化性能，而且制备的微胶囊能够承受各种加工条件如pH值、温度和离子强度的变化[2]。Karaca等[3]以质量分数为4%的鹰嘴豆或扁豆分离蛋白和35.5%的麦芽糊精为复合壁材，包埋10.5%的亚麻籽油，制备的微胶囊包埋率达到最高，并且复溶后液滴粒径较小。

米糠蛋白具有易消化、不易致敏和抗癌等特性，但是表面疏水性较低，导致其在两相界面上吸附能力变差[4]；米糠蛋白乳化稳定性较好，但乳化活性较差[5]。超声波具有穿透力好、受力均匀性好等特点，有研究表明，米糠蛋白经超声改性后溶解性、乳化性和起泡性得到明显的改善[6-7]。

作者首先优化米糠蛋白的超声改性工艺条件，以获得具有较好乳化性的蛋白，然后与麦芽糊精按适当比例复配充当壁材，包埋亚麻籽油。研究改性蛋白对微胶囊粉末油脂包埋率、复溶后粒径和电位、微观结构的影响，并分析其中蛋白二级结构的变化，为开发新型微胶囊壁材和扩大亚麻籽油的应用范围提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

米糠蛋白：自制(蛋白含量60.35%±0.31%)；大豆油：山东万德福实业集团有限公司；亚麻籽油：低温冷榨，呼和浩特市维拓食品有限公司；麦芽糊精：BR级，北京索莱宝科技有限公司；单甘酯：食品级，临沂森普食品有限公司；其他试剂均为化学纯或分析纯。

1.2 仪器与设备

K1160全自动凯式定氮仪：山东海能科学仪器有限公司；高速剪切乳化机：德国FLUKO流体机械制造公司；高速离心机：上海安亭科学仪器厂；722S可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；PHS-3C型精密酸度计：上海大普仪器有限公司；超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；S-3400 N扫描式电子显微镜：日本Hitachi公司；Zetasizer NanoZS90 激光粒度仪：英国Malvern 仪器有限公司；傅立叶红外光谱仪：美国NICOLET公司；小型台式喷雾干燥机：瑞士 Buchi 实验室仪器公司；荧光分光光度计RF-5301：日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 超声改性米糠蛋白

配置一定质量浓度的米糠蛋白溶液，调pH值至 7，室温下磁力搅拌2 h。超声过程中，始终控制蛋白溶液温度在35 ℃以下，设置功率和时间，超声处理程序为处理2 s，停2 s。一部分使用蒸馏水稀释至质量分数为1%，测定其溶解度和乳化性，另一部分经冷冻干燥后测定结构。

1.3.2 溶解度的测定

用移液枪吸取10 mL超声改性米糠蛋白于烧杯中，4 500 r/min下离心20 min。吸取4 mL上清液，参考GB/T 5009—2010测定蛋白质含量，溶解度计算公式如下：

1.3.3 乳化性的测定

乳化性的测定参考Phongthai等[8]的方法，略有改动。用移液枪吸取一定量的超声改性米糠蛋白于50 mL离心管中，调节pH值为8，将蛋白溶液和大豆油按体积比1∶3混合，室温下磁力搅拌30 min，使用10 000 r/min的均质剪切机剪切1 min，立即从容器底部吸取50 μL混合液，用质量分数为0.1%的SDS溶液稀释100倍，于波长500 nm下测定吸光值(A0)，10 min后再次测定吸光值(A10)。乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性(ESI)计算公式如下：

式中：N为稀释倍数，100；C为水溶液中蛋白质质量浓度，1 g/100 mL；φ=0.25，水溶液中油的体积分数。

1.3.4 微胶囊粉末油脂的制备工艺

微胶囊粉末油脂的制备参考Karaca等[3]的方法，略有改动。按照表1准确称料后，使水相混合物(蒸馏水、麦芽糊精、改性米糠蛋白)完全溶解，在65 ℃下使油相混合物(亚麻籽油、单甘酯)充分分散，二者混合并乳化30 min，然后在均质压力40 MPa下循环2次，制得的料液在进风温度为180 ℃、出风温度为90～110 ℃的条件下喷雾干燥制得亚麻籽油粉末油脂。

表1 微胶囊粉末油脂配方Table 1 Formula of microcapsulated powder oil g

1.3.5 微胶囊粉末油脂表面含油量的测定

参照张雪春等[9]的方法，稍做修改。称取2 g样品(m)于锥形瓶中，加入40 mL石油醚，搅拌2 min，过滤到圆底烧瓶中，回收滤液中的石油醚，烘干至恒质量，计算表面油脂的质量(m1)。

1.3.6 微胶囊粉末油脂总油量的测定

参照李坚仁等[10]的方法，稍做修改。准确称取1 g样品置于100 mL锥形瓶中，加入10 mL盐酸，75 ℃水浴中振荡10 min，再加入10 mL乙醇，冷却后加25 mL石油醚，静置后吸出上清液，再经石油醚重复提取2次，旋转蒸发回收石油醚，并烘至恒质量，根据质量变化计算粉末油脂产品的含油量。

1.3.7 微胶囊粉末油脂包埋率的计算

1.3.8 微胶囊粉末油脂复溶后的粒径测定

参考Shao等[11]的方法，略有改动。用蒸馏水将两种微胶囊粉末油脂稀释至质量分数为0.005%，采用激光粒度仪测定乳液粒径，以乳液粒度分布为指标记录试验结果。

1.3.9 微胶囊粉末油脂复溶后的zeta-电位测定

参考Shao等[11]的方法，略有改动。用蒸馏水将两种微胶囊粉末油脂稀释至质量分数0.005%，采用激光粒度仪测定乳液电位(25 ℃)。

1.3.10 微胶囊粉末油脂微观结构的观察

利用扫描电子显微镜观察微胶囊粉末油脂的微观结构，参照李伟伟[12]的方法，稍做修改。设置加速电压为3 kV，放大倍数2 000～5 000倍。

1.3.11 傅立叶红外光谱分析

微胶囊粉末油脂样品和KBr按1∶100混合，研磨均匀后进行压片。以纯KBr为参照样，在波数400～4 000 cm-1下进行傅立叶红外扫描。对红外吸收曲线进行二级求导，光谱数据用Peakfit 4.12软件进行分析。

1.3.12 游离巯基、二硫键含量的测定

参考吴伟等[14]的方法，略有改动。采用 5，5′-二硫代二硝基苯甲酸盐比色法测定米糠蛋白总巯基和游离巯基含量，以13 600 mol/(L·cm)消光系数进行计算。总巯基与游离巯基差值的一半即为二硫键含量。

1.3.13 表面疏水性的测定

参考吴伟等[14]的方法，略有改动。取100 mg米糠蛋白溶解于0.01 mol/L、pH 7的磷酸盐缓冲液中，室温下磁力搅拌2 h后5 000 r/min离心20 min，收集上清液。用磷酸盐缓冲液将蛋白质量浓度稀释为0.005、0.125、0.245、0.365、0.485 mg/mL。取4 mL上清液，加入20 μL的0.008 mol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸，混合均匀，在激发波长390 nm和发射波长470 nm下测定荧光强度。以荧光强度对蛋白质量浓度作图，采用最小二乘法进行曲线拟合，直线斜率即为蛋白质的表面疏水性。

1.4 数据统计与分析

每组试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。采用 SPSS 20软件对数据进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著，使用Duncan’s进行多重比较。采用Origin 8.5软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 米糠蛋白超声改性的工艺优化

2.1.1 超声功率密度对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响

在超声时间30 min、蛋白质量浓度4 g/100 mL的条件下，研究超声功率密度对米糠蛋白溶解性、乳化活性指数和乳化稳定性的影响，结果见图1。

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)，图2、图3同。图1 超声功率密度对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响Fig.1 Effect of power density on the solubility and emulsibility of rice bran protein

由图1可知，在超声功率密度5 W/mL时米糠蛋白的溶解度、乳化活性指数和乳化稳定性均达到最大值。继续增加功率密度，溶解度降低，这可能由于此时超声促使米糠蛋白暴露出更多的疏水性基团，疏水相互作用增强，导致不溶性小聚集体的产生[15]，进而降低蛋白乳化性。因此，选择功率密度为5 W/mL。

2.1.2 超声时间对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响

在超声功率密度5 W/mL，蛋白质量浓度4 g/100 mL的条件下，研究超声时间对米糠蛋白溶解性、乳化活性指数和乳化稳定性的影响，结果见图2。

图2 超声时间对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the solubility and emulsibility of rice bran protein

由图2可知，米糠蛋白溶解度随超声时间增大而增大，这与Nazari等[16]研究超声改性小米浓缩蛋白的结果一致。超声30 min时米糠蛋白乳化活性和乳化稳定性均达到最高。这与王长远等[7]的研究结果一致。因此，选择超声时间为30 min。

2.1.3 蛋白质量浓度对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响

在超声功率密度5 W/mL，超声时间30 min的条件下，研究蛋白质量浓度对米糠蛋白溶解性、乳化活性指数和乳化稳定性的影响，结果见图3。

由图3可知，米糠蛋白溶解度在质量浓度为4 g/100 mL时达到最大值，随后出现了急剧下降趋势，可能是因为此时液体黏稠性增强，严重影响了超声产生的空化效果。乳化活性指数和乳化稳定性在蛋白质量浓度为4 g/100 mL时均达到最大值，可能是在低浓度下超声促使米糠蛋白暴露出更多的亲水和疏水性基团，也可能是由于蛋白粒径减小，能够快速地吸附到界面上，降低界面张力，使乳化性得到改善。因此，选择蛋白质量浓度为4 g/100 mL。

2.1.4 验证试验

根据单因素试验结果进行验证试验，试验条件为超声功率密度5 W/mL、超声时间30 min、蛋白质量浓度4 g/100 mL，并对比了改性前后米糠蛋白的溶解度和乳化性，结果见表2。

由表2可知，超声改性后米糠蛋白溶解度显著提高了171.06%，可能是因为超声处理促使米糠蛋白粒径减小，与水分子之间的接触面积增加[17]；乳化活性指数和乳化稳定性分别显著提高了60.4%和107.79%，可能是由于超声使蛋白分子结构部分展开，导致更多的分子聚集到油-水界面上，形成较厚的内聚性膜。

图3 蛋白质量浓度对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响Fig.3 Effect of the mass concentration of protein on the solubility and emulsibility of rice bran protein

表2 改性前后米糠蛋白溶解度和乳化性的对比
Table 2 Comparison of solubility and emulsibility
of rice bran protein before and after modification

样品溶解度/%乳化活性指数/(m2·g-1)乳化稳定性/min米糠蛋白29.16±1.2812.45±0.4080.97±3.10超声改性米糠蛋白79.04±0.6619.97±0.17168.25±3.32

2.2 改性前后米糠蛋白二硫键含量和表面疏水性分析

由表3可知，米糠蛋白超声改性后二硫键含量降低，可能是超声产生的空化作用打断了二硫键，使得蛋白结构展开，极性基团朝向水相，溶解度增大，进而改善了乳化性[18]。从图2和表3可知，尽管超声改性后米糠蛋白表面疏水性增强，但溶解度远高于对照样，可能原因是超声破坏了蛋白分子之间的静电引力，导致蛋白分子分散，不易聚集，进而引起溶解度增大[19]，改善了乳化性。除此之外，表面疏水性也同样重要，因为大量的疏水性基团有利于蛋白质胶束的形成，使其更好地吸附和保留在油-水界面上。

表3 改性前后米糠蛋白二硫键含量和表面疏水性Table 3 Disulfide bond contents and surface hydrophobicity of rice bran protein before and after modification

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)，表4、表5同。

2.3 微胶囊粉末油脂表面含油量和包埋率分析

由表4可知，添加超声改性米糠蛋白的微胶囊粉末油脂表面含油量显著低于添加对照样的，而包埋率显著增高。可能是因为米糠蛋白经超声改性后乳化性得到改善，使得在喷雾干燥时易形成致密的保护膜[20]。此外，黏度是微胶囊化过程中需要控制的重要参数，它可以影响干燥过程中乳液的稳定性和流动行为，进料黏度较高时会延长干燥过程，形成细长颗粒，导致颗粒中含有空气，进而影响油的包埋效果，这与Chang等[21]的研究结果一致。样品2在喷雾干燥之前黏度降低可能是由超声降低蛋白粒径引起的。

表4 微胶囊粉末油脂表面含油量和包埋率Table 4 Surface oil content and encapsulation rate of microcapsulated powder oil %

注：样品1为添加米糠蛋白微胶囊粉末油脂；样品2为添加超声改性米糠蛋白微胶囊粉末油脂，图4、图5、表5同。

2.4 微胶囊粉末油脂的微观结构分析

注：a为样品1；b为样品2。图4 微胶囊粉末油脂群体的扫描电子显微镜图Fig.4 Scanning electron microscopy of microcapsulated powder oil group

两种微胶囊粉末油脂群体扫描电子显微镜图见图4。样品1群体图像颗粒黏结现象较严重并有破裂颗粒。样品2黏着现象不明显，壁材完整，基本无破裂现象，并且颗粒较小，有利于其在溶液中溶解。这与表4显示样品2包埋率较高，样品1包埋率较低的结果一致。

2.5 微胶囊粉末油脂复溶后的粒径和zeta-电位

两种微胶囊粉末油脂复溶后的粒径见图5。样品1和2复溶后zeta-电位分别为(-23.9±0.17) V和(-25.9±0.43) V。乳液粒径大小和带电量与乳液稳定性有关。由图5可知，相对于样品1，样品2复溶后乳滴粒径分布图向粒径小的方向移动，这可能是由于样品2油滴的zeta-电位较高，使得油滴不易聚集。