不同糖源对酵母生长及糖利用的影响

雷雅男，谢东东，谢岩黎

河南工业大学 粮油食品学院，河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室，河南 郑州 450001

小麦粉面团中可发酵的糖有3个来源：游离的单糖(葡萄糖、果糖)、二糖(蔗糖、麦芽糖)、三糖；受损淀粉；果聚糖(由果糖单元组成)[1-4]。面团中这些可发酵糖的含量影响面团的发酵进程，包括发酵过程的产气量、面团的发育等，且发酵期间面团的高度、气体产量与糖的类型有显著的相关性[5]。研究表明，蔗糖可以增加面团的延展性，赋予面团更柔软、更黏稠的质地[6]。面团中麦芽糖含量高可以延长发酵时间，葡萄糖/麦芽糖的比值大则有较高的发酵速率[7]。面团发酵180 min后，酵母浓度最高的面团中很少有葡萄糖、果糖和麦芽糖，几乎完全发酵[8]。破损淀粉分解后也能被酵母所利用，一般认为大分子的淀粉不能被酵母分解利用，但是在特定条件或者极端环境下酵母能否利用淀粉，还需要进一步探究。

面团的发酵是酵母对糖的利用，糖为酵母的生长代谢提供能量和构建细胞组成的碳骨架，直接或间接调节所有主要的代谢途径[9-11]。酵母的生长分为3个阶段：初始阶段可发酵糖为碳源，细胞迅速生长和分裂，该阶段称为指数生长；当培养基中碳源为限制因素时，细胞生长速率下降，从发酵代谢转变为呼吸代谢，生长阶段转变至二次生长；当营养物质耗尽，细胞进入静止期，生长停滞，生物量保持恒定[12-13]。

酵母对面团中几种糖的发酵规律，大多数研究是从面团发酵过程中糖浓度的变化、气体的产生以及面团的发育出发建立一系列的相关性[5]。面团是一个复杂的发酵体，对于酵母和单一糖源之间的关系目前没有具体的探究，因此作者采用培养基模拟面团中酵母利用不同糖源发酵的模式，观察酵母对单一糖源的利用及自身的生长规律，对酵母的生长期进行研究。通过研究酵母对不同糖源的利用，调节面团的发酵进程从而达到预定的发酵效果，为生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨、酵母膏：分析纯，北京奥博星生物技术有限公司；KH2PO4：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；K2HPO4、MgSO4·7H2O、氯化钠、可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

THZ-92B气浴恒温振荡器：上海跃进医疗器械有限公司；UV-6100S紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司； pHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DHG-9073BS电热恒温鼓风干燥箱：广州沪瑞明仪器有限公司；DL-5-B 离心机：上海安亭科学仪器厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 培养基的制备[7-8]

种子培养基：称取KH2PO40.1 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 0.1 g于锥形瓶中，加水100 mL，溶解后灭菌20 min，取出放凉备用[5]。

葡萄糖培养基：称取KH2PO40.1 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 0.1 g、葡萄糖2 g于锥形瓶A中，加30 mL水溶解；称取蛋白胨2 g、酵母膏1 g于锥形瓶B中，加30 mL水溶解；灭菌后混合，加蒸馏水至100 mL备用[15-16]。

麦芽糖、淀粉培养基与葡萄糖培养基制备方法相同，无糖培养基作为对照组。

1.3.2 种子液的培养

称取5 g活性干酵母于种子培养基中，封口后在30 ℃、180 r/min条件下培养30 min。

1.3.3 酵母生长曲线的绘制

按2%(体积比)的接种量取种子液于4种培养基中，30 ℃、180 r/min振动培养22 h。每隔2 h取样1次，在波长 600 nm下测定OD值，绘制酵母细胞0～22 h的生长曲线[17-18]。

另外按2%(体积比)的接种量取种子液于葡萄糖和麦芽糖培养基中，培养3 h，每隔15 min取样1次，在波长 600 nm下测定OD值，绘制酵母细胞0～180 min的生长曲线。

1.3.4 酵母生长速率曲线的绘制

按照生长速率公式：μ=(lnX2-lnX1)/(t2-t1)计算酵母各个时间点的生长速率，并绘制生长速率曲线[19]。其中X1、X2分别为酵母细胞培养液在时间t1、t2的OD600值。

1.3.5 酵母在不同生长阶段细胞形态的变化

根据酵母的生长曲线，分别取延滞期、对数生长期前期、对数生长期后期、稳定期前期、稳定期后期对应的5个时间点的酵母进行观察，具体参照李勤[17]的方法。

细胞形状[20]分为圆形、椭圆形、近纺锤形3种形状；在40倍光学显微镜下对视野内细胞的大小进行评估，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个等级，依次变大；细胞聚集情况分为完全分散、部分聚集、大量聚集、完全聚集4种形态；出芽情况分为无出芽、个别出芽、少量出芽、大量出芽4种状态。

1.3.6 葡萄糖浓度的测定

葡萄糖培养基取样的时间点分别为0、1、2.5、5、7、18 h，麦芽糖培养基的取样时间点分别为0、1、3、7、9、20 h。收集培养液于离心管中，5 000 r/min离心10 min，收集所得上清液，稀释10倍后采用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖浓度。

1.3.7 麦芽糖含量的测定

采用李珊[21]的方法测定麦芽糖含量。取2 mL麦芽糖溶液和2 mL DNS于比色管中混匀，沸水浴10 min后迅速冷却，加蒸馏水定容至25 mL，在540 nm下测定吸光值，纵坐标为吸光度，横坐标为麦芽糖含量，制作麦芽糖的标准曲线，y=0.654 3x-0.094 6 (R2=0.999 6)。按照标准曲线测定方法计算麦芽糖含量。

1.3.8 淀粉含量变化趋势的测定

取2 g/L淀粉标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于100 mL 棕色容量瓶中，然后加入1.0 mL 0.01 mol/L I2-KI 标准溶液，加水稀释至刻度，摇匀，第一个容量瓶作空白，在600 nm 处测定此系列溶液的吸光度[22]。以吸光度为纵坐标，淀粉含量为横坐标，得到标准曲线y=0.299 4x+0.012 5(R2=0.994 9)。收集培养液于离心管中，5 000 r/min离心10 min，收集所得上清液，适当稀释后测定淀粉含量。

1.3.9 不同糖源的酵母培养基pH值的测定

每隔1 h收集1次酵母细胞培养液，测定0～22 h不同糖源培养基的pH值。

1.4 数据处理

数据以平均值±标准偏差来表示，采用SPSS 16.0 进行单因素方差分析，采用 Origin 8.5作图。

2 结果与讨论

2.1 糖源对酵母生长的影响

2.1.1 糖源对酵母22 h内生长的影响

酵母在葡萄糖、麦芽糖、淀粉、无糖培养基中的生长结果如图1和图2所示。

图1 酵母在4种培养基中的生长曲线Fig.1 Growth curve of yeast in four media

图2 酵母在4种培养基中的生长速率Fig.2 Growth rate of yeast in four media

由图1可知，酵母在葡萄糖和麦芽糖培养基中0～22 h有明显的延滞期、对数生长期、稳定生长期，而在淀粉和无糖培养基中0～22 h没有明显的生长阶段。这表明0～22 h酵母能利用葡萄糖和麦芽糖维持自身生长，不能直接利用淀粉。而酵母在淀粉培养基的吸光值偏大，可能是因为淀粉分子颗粒大，溶解度低，培养基较为浑浊。

由图2可知，对数生长期时，酵母在葡萄糖培养基4 h时生长速率最大，在麦芽糖培养基6 h时生长速率最大。酵母能直接利用葡萄糖进行生长增殖，而麦芽糖分解成葡萄糖后才能被利用。稳定期时，酵母的生长速率几乎为零。在淀粉和无糖环境中，酵母没有明显的生长阶段，说明酵母没有可利用的糖源，不能生长。酵母不能直接利用淀粉，淀粉需要在酶的作用下分解为麦芽糖才能被利用[7]。

2.1.2 糖源对酵母3 h内生长的影响

酵母在葡萄糖和麦芽糖培养基中3 h的生长结果如图3和图4所示。

图3 酵母在2种培养基中3 h内的生长曲线Fig.3 The first 3 h growth curve of yeast in two media

图4 酵母在2种培养基中3 h内的生长速率Fig.4 The first 3 h growth rate of yeast in two media

从图3和图4可以看出，酵母在两种培养基中的生长曲线大致相同，在葡萄糖培养基中120 min后进入对数期，而在麦芽糖培养基中150 min后进入对数期。酵母在麦芽糖培养基中的延滞期长，这是因为葡萄糖能直接被酵母转运至细胞内进行利用[2]，而麦芽糖需要被分解后才能被利用。对数期酵母在麦芽糖培养基中生长速率加快，这是因为酵母分泌麦芽糖酶将麦芽糖分解成葡萄糖，培养基中可利用的糖总量增加。

结合图1生长曲线可以得出：在葡萄糖培养基中，0～2 h为延滞期，2～6 h为对数生长期，6～22 h为稳定期；在麦芽糖培养基中，0～2.5 h为延滞期，2.5～8 h为对数生长期，8～22 h为稳定期；在淀粉和无糖培养基中，0～22 h无明显生长阶段。

2.2 不同糖源对酵母各生长阶段细胞形态的影响

2.2.1 不同糖源中酵母细胞观察时间点的选取

根据生长曲线，选取观察酵母细胞形态的时间点如表1所示。

表1 4种培养基中的酵母菌观察时间点Table 1 Observation time of yeast in four media h

2.2.2 不同糖源对酵母细胞形态的影响

由表2可知，延滞期时，葡萄糖培养基中的细胞个体大，出芽早，这说明酵母能更早识别利用葡萄糖为细胞生长增殖做准备。对数期后期时，葡萄糖和麦芽糖培养基中的酵母细胞均大量出芽，麦芽糖培养基中的酵母细胞聚集程度高，这是由于对数生长期的酵母酶系活跃，代谢旺盛[23]。稳定期后期时，在葡萄糖和麦芽糖培养基中酵母细胞形态多呈近圆形，与淀粉培养基和无糖培养基相比，细胞大、数量多。稳定期时，葡萄糖培养基与麦芽糖培养基中的酵母细胞都较为分散，几乎没有生长。这可能是随着培养基中的糖源消耗，营养物比例失调[23]，代谢产生的乙醇等产物限制了酵母的生长，使其数量处于动态平衡之中。

表2 不同观察时期酵母的形态Table 2 Yeast morphology at different observation time

在淀粉和无糖培养基中，5个观察时间点中只有第3小时观察到酵母有少量出芽增殖的情况，可能是培养基中所添加的酵母膏或细胞内积累的少量营养物质为其提供少量碳源维持其生长增殖[9, 24]。在这两种培养基中细胞生长缓慢、数量少、个体小。在淀粉培养基中的酵母细胞聚集程度高，这可能是在蒸汽灭菌阶段，淀粉分子糊化，淀粉体积膨胀、颗粒解体，限制了酵母细胞的活动。

2.3 不同糖源对酵母糖利用的影响

2.3.1 不同糖源对培养基中糖含量的影响

酵母在不同生长时期，培养基中糖含量变化如图6—图9所示。

图6 葡萄糖培养基中葡萄糖浓度变化Fig.6 Change of glucose concentration in glucose medium

图7 麦芽糖培养基中葡萄糖浓度变化Fig.7 Change of glucose concentration in maltose medium

图8 麦芽糖培养基中麦芽糖含量变化Fig.8 Change of maltose content in maltose medium

图9 淀粉培养基中淀粉含量变化Fig. 9 Change of starch content in starch medium

由图6可知，在葡萄糖培养基中0～7 h葡萄糖浓度下降，7 h之后趋于稳定。这表明酵母在发酵过程中消耗葡萄糖，导致其浓度下降。在对数生长期时，酵母大量增殖，消耗葡萄糖的速度也在加快。稳定期后，培养基中的葡萄糖浓度很少，此时酵母数量变化很小，生长速率几乎为零。一方面，培养基中的葡萄糖消耗将尽；另一方面，代谢产生的乙醇等产物和pH值的下降限制了酵母的生长。

由图7和图8可知，在麦芽糖培养基中麦芽糖含量逐渐下降，而葡萄糖的浓度呈现先逐渐上升后下降的趋势，这说明酵母将麦芽糖分解成葡萄糖，能间接利用麦芽糖[25]。在2～8 h，麦芽糖培养基中麦芽糖被分解成葡萄糖，出现“供”大于“求”，从而葡萄糖浓度增加。随着酵母的生长，葡萄糖浓度呈现下降趋势[26]，这是因为酵母消耗葡萄糖的速度大于麦芽糖分解的速度。稳定期后，葡萄糖浓度很低，酵母数量达到饱和，生长速率几乎为零。

由图9可知，在淀粉培养基中淀粉含量无明显变化，酵母数量无明显变化，表明酵母细胞在0～22 h内，几乎没有分解利用淀粉。

2.3.2 不同糖源对培养基pH值的影响

4种培养基的pH值变化如图10所示。在葡萄糖和麦芽糖培养基中，pH值呈先下降后稳定的趋势，这是因为酵母代谢旺盛，代谢产物琥珀酸能影响培养基的pH值[8]。在葡萄糖培养基中，稳定期后葡萄糖含量下降[27]，酵母数量也趋于稳定，pH值后期趋于稳定，这可能是酒精的累积、大分子物质的分解和弱碱性物质(碱性氨基酸、核苷酸、高级醇等)的大量增加所引起的[25]。在淀粉培养基中，培养基的pH值和淀粉的含量变化不明显，表明在0～22 h酵母细胞没有利用淀粉[28]。

图10 4种糖源培养基pH值的变化Fig.10 Changes of pH in four media

3 结论

酵母在含有葡萄糖和麦芽糖的培养基中能大量生长增殖，均有明显的延滞期、对数期和稳定期。酵母在麦芽糖培养基中比在葡萄糖培养基中的对数生长期长，对麦芽糖的利用速度低于葡萄糖。酵母在淀粉培养基和无糖培养基中无明显的生长阶段，细胞数量在22 h内仅有少量增殖，但酵母细胞能否在长期的饥饿状态下适应性地间接分解利用淀粉，还需要做进一步的研究。