超声辅助碱醇法提取青麦仁麸皮中阿魏酸的工艺研究

杨徐宁，张国治

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

阿魏酸化学名为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸(Ferulic acid, FA)，具有较强的抗氧化性和还原性，见光容易分解[1]。阿魏酸是一种生物活性物质，既是抗氧化剂又是抗炎症因子，这些功能特性使得阿魏酸被广泛应用到日化和医药行业[2]。

青麦仁是乳熟后期、蜡熟期的小麦籽粒，含有丰富的蛋白质、膳食纤维和α、β-淀粉酶[3]，还含有酚酸类和黄酮类等活性物质。现代营养学赋予麸糠类物质的新功能，引起了国外学者对其研究、开发及应用的极大兴趣[4]。青麦仁麸皮中的主要酚酸类物质为阿魏酸，其含量高达14.435 mg/g，至少是黑小麦和普通小麦麸皮的6倍和12倍[5-6]，可见阿魏酸提取工艺的研究对青麦仁麸皮的开发利用具有重要意义。

在谷物中，麸皮中的阿魏酸通常通过羧酸基团与木聚糖的α-1-阿拉伯糖基侧链的羟基形成酯键与细胞壁聚合物连接[7-8]。因此，作者采用碱醇法破坏酯键释放结合型阿魏酸，并利用超声波技术缩短提取时间，可提高青麦仁麸皮中阿魏酸的提取率，并添加0.2 g/L的亚硫酸钠，以提高青麦麸中阿魏酸保留率[5]。本研究为青麦仁麸皮的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青麦仁购自付利基地；95%乙醇、氢氧化钠、亚硫酸钠等为国产分析纯；甲醇、三氟乙酸为色谱纯；超纯水、阿魏酸标准品(20 mg)购自北京索莱宝公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平：上海菁海仪器有限公司；A590型紫外可见分光光度计：上海翱艺仪器有限公司；KQ-600DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司；JW-1042型低速离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；1260型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 阿魏酸提取工艺

对青麦麸进行去淀粉、去蛋白、去色素处理后，进行冷冻干燥。取一定量预处理后的青麦麸、氢氧化钠和95%的乙醇置于小烧杯中并封口，放入超声清洗器，在特定超声条件下反应一段时间后，以4 000 r/min离心10 min，向容量瓶中加入2.5 mL 0.2 g/L的亚硫酸钠，收集上清液并定容，用蒸馏水洗残渣后离心，重复上述步骤3次，平行试验进行3次[9]。

1.3.2 阿魏酸的检测方法

采用Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为0.05%三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇；柱温30 ℃，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，检测波长315 nm。梯度洗脱与等度洗脱结合如下：0 min，流动相A 100%；10 min，流动相A 85%，流动相B 15%；15 min，流动相A 15%，流动相B 85%；20 min，流动相A 15%，流动相B 85%[10-11]。

1.3.3 阿魏酸标准曲线的建立

精确称取阿魏酸标准品20 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，添加甲醇至刻度，摇匀，制得2 mg/mL的标准品溶液；用标准品溶液分别制成质量浓度为0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL的溶液各1 mL[12]。采用1.3.2中的方法测定峰面积，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.4 单因素试验

通过预试验考察了料液比、碱醇体积比、碱液质量浓度、超声功率、超声时间和超声温度对青麦仁麸皮中阿魏酸提取率的影响[13]，确定超声功率、碱醇体积比、碱液质量分数和超声温度为主要影响因素，在料液比为1∶12(g/mL)、超声时间30 min时进行单因素试验。青麦麸中阿魏酸提取率按下式计算：

阿魏酸提取率=M1/M0×100%，

式中：M1为提取液中阿魏酸的质量，mg；M0为青麦麸中阿魏酸的总质量，14.435 mg。

而从医院本身来讲，无锡市人民医院是一个体量很大的医院。它是由原无锡市第一人民医院、儿童医院和第五人民医院于2007年11月整建组合而成的，是无锡地区最大的公立医院。医院占地270亩，建筑面积32.486万平方米，根据不同功能以英文字母分成了行政，门诊，医技检查，病房，急诊、手术中心，后勤综合楼，感染性疾病区，儿童医院，心肺诊疗中心，体检中心、特诊中心10个区域。

1.3.5 Box-Behnken试验设计

在单因素试验的基础上，以超声功率、碱醇体积比、碱液质量浓度和超声温度为考察因素，通过Design-Expert 8.0.6软件，设计四因素三水平Box-Behnken试验[14]，优化青麦仁麸皮中阿魏酸的提取工艺。

2 结果与分析

2.1 阿魏酸的标准曲线

图1、图2分别为阿魏酸标准品高效液相色谱图和阿魏酸标准曲线。图3为青麦仁麸皮阿魏酸的高效液相色谱图。

图1 阿魏酸标准品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of ferulic acid standard

图2 阿魏酸标准曲线Fig.2 Standard curve of ferulic acid

图3 青麦仁麸皮阿魏酸高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of ferulic acid from green wheat bran

由图1和图3可知，阿魏酸标准品和青麦麸中阿魏酸的保留时间均为16.5 min左右。由图2可见，建立的标准曲线回归方程为Y=25 159X+97.026(R2=0.999 4，n=5)，其中X为阿魏酸质量浓度，Y为峰面积。阿魏酸质量浓度在0～0.5 mg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声功率对阿魏酸提取率的影响

图4 超声功率对阿魏酸提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of ferulic acid

由图4可知，在料液比为1∶12(g/mL)、碱醇体积比为2∶1、碱液质量分数为4%、超声温度为60 ℃、超声时间为30 min的条件下，随着超声功率增大，青麦仁麸皮阿魏酸提取率呈先增大后减小的趋势，在超声功率为210 W时，提取率达到最大。原因可能是游离的阿魏酸不稳定，超声功率过大会促使其分解，导致提取率下降。因此，选取最佳超声功率为210 W。

2.2.2 碱醇体积比对阿魏酸提取率的影响

在料液比为1∶12(g/mL)，碱液质量分数为4%，超声温度为60 ℃、超声功率为240 W、超声时间30 min的条件下，考察碱醇体积比对阿魏酸提取率的影响，结果见图5。由图5可见，随着碱醇体积比的增大，阿魏酸提取率呈先增大后减小的趋势，这说明碱液量过小时，只能使部分阿魏酸被释放，而碱醇体积比达到2∶1时，阿魏酸提取率最大。因此，选择碱醇体积比为2∶1。

图5 碱醇体积比对阿魏酸提取率的影响Fig.5 Effect of alkali alcohol volume ratio on extraction rate of ferulic acid from green wheat bran

2.2.3 碱液质量分数对阿魏酸提取率的影响

在料液比为1∶12(g/mL)，碱醇体积比为2∶1，超声温度为60 ℃、超声功率为240 W、超声时间30 min的条件下，考察碱液质量分数对阿魏酸提取率的影响，结果见图6。由图6可知，随着碱液质量分数增大，阿魏酸提取率呈先增大后减小然后平稳的趋势。碱液质量分数过小时，不能使阿魏酸与多糖等大分子物质分离，而碱液质量分数达到4%时，阿魏酸提取率最大。因此，选择碱液质量分数为4%[13]。

图6 碱液质量分数对阿魏酸提取率的影响Fig.6 Effect of alkali mass fraction on extraction rate of ferulic acid

2.2.4 超声温度对阿魏酸提取率的影响

在料液比为1∶12(g/mL)，碱醇体积比为2∶1，碱液质量分数为4%，超声时间为30 min、超声功率为240 W的条件下，考察超声温度对阿魏酸提取率的影响，结果见图7。由图7可知，随着超声温度升高，阿魏酸提取率呈先增大后减小的趋势，当温度达到60 ℃时，提取率达到最大，原因可能是温度过高会造成阿魏酸与提取液中的其他物质发生反应，从而降低提取率。综合考虑，选择最佳超声温度为60 ℃。

图7 超声温度对阿魏酸提取率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of ferulic acid

2.3 响应面优化试验

Box-Behnken优化试验设计及结果见表1。通过Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行响应面分析，得到模拟回归方程为：

Y=81.01-0.80A+3.29B-1.08C+3.08D+0.65AB-0.29AC+1.27AD-4.53BC-6.98BD+3.65CD+4.65A2-7.40B2-4.72C2-4.09D2。

由表1可知，在不同组合条件下青麦仁麸皮中阿魏酸提取率为51.47%～83.97%，说明阿魏酸提取率受不同因素组合的影响较大。因此，采用响应面法优化青麦仁麸皮阿魏酸的提取工艺具有可行性。

表1 Box-Behnken试验设计及结果Table 1 Design and results of Box-Behnken experiments

各因素的交互作用对青麦仁麸皮的阿魏酸提取率的影响见图8、图9。由图8、图9可知，碱液质量分数与超声温度、碱醇体积比与超声温度曲面稍陡峭且等高线密集程度适中。在表2中BC显示显著，表明碱液质量分数B与提取温度C有较强的交互作用；随碱醇体积比的增大阿魏酸提取率呈先增大后小幅减小的趋势，这可能是因为初期碱液量过小，无法使大部分阿魏酸分解成游离状态，后期碱液量过大、醇用量过小可能使提取液流动性减小以及无法使游离出的阿魏酸溶解，也可能因为碱和部分阿魏酸中和从而影响阿魏酸的提取率。

表2 方差分析Table 2 Variance analysis

注：*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。

通过响应面法优化得到了超声辅助碱醇法提取青麦仁麸皮阿魏酸的最佳工艺条件，考虑试验的可操作性，对最佳理论提取工艺条件进行调整，即超声功率240 W、碱液质量分数4.56%、超声温度57 ℃、碱醇体积比2.3∶1。在该条件下进行验证试验，得到阿魏酸的实际提取率为 85.68%，与理论值86.06%接近。试验结果表明，响应面法优化模型能很好地预测青麦仁麸皮阿魏酸的提取率，其最佳工艺条件及预测结果具有可靠性。

图8 碱液质量分数和超声温度交互作用对阿魏酸提取率的影响Fig.8 Effect of interaction between alkali mass fraction and ultrasonic temperature on the extraction rate of ferulic acid

图9 超声温度与碱醇体积比的交互作用对阿魏酸提取率的影响Fig.9 Effect of interaction between ultrasonic temperature and alkali alcohol volume ratio on the extraction rate of ferulic acid

3 结论

超声辅助碱醇提取法具有操作简单、易于控制、提取时间短、阿魏酸提取率较高的特点。通过单因素试验和响应面优化试验，得到超声波辅助碱醇法提取青麦仁麸皮中阿魏酸的最佳工艺条件：料液比1∶12、超声时间30 min、超声功率240 W、碱液质量分数4.56%、超声温度57 ℃、碱醇体积比2.3∶1，在此条件下得到青麦麸阿魏酸提取率为85.68%，与理论值86.06%接近，说明该模型与实际情况较为吻合。本研究为探究青麦仁麸皮中的活性物质阿魏酸提供了试验数据，有利于青麦仁的开发利用与功能性食品的制备。