胎盘淋巴细胞凋亡及CD44表达水平与子痫前期的相关性研究*

黄 海，陈 梅，马 丽，李景平

深圳市南山区西丽人民医院，广东 深圳 518000

子痫前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特发的多系统类型疾病，是一种因血管痉挛致器官灌注量低于内皮激活的继发疾病。该疾病对围生期母婴安全造成极大威胁而作为产科病理学的重点研究项目，现有研究未能较好阐明该病的发病机制，对子痫前期的早诊治产生不良影响。CD44为最主要的淋巴细胞归巢受体，其在淋巴细胞再循环、活化及炎症反应中发挥重要作用，影响母体与胎儿的免疫平衡。现有研究认为胎盘滋养细胞的凋亡及Fas/FasL调控系统的表达与子痫前期发生存在联系，较少研究提出CD44在子痫前期产妇淋巴细胞中的表达与淋巴细胞凋亡相关性，本研究本研究通过对我院子痫前期产妇及正常产妇胎盘淋巴细胞凋亡及CD44表达水平来探索其与子痫前期的相关性，现将本次研究报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以深圳市南山区西丽人民医院2016年6月1日-2017年11月30日住院分娩的无产科合并症及内外科合并症产妇120例为研究对象，其中子痫前期产妇60例为研究组，正常产妇60例为对照组。子痫诊断标准：以《实用妇产科学》［1］中有关子痫前期的诊断标准为标准进行临床诊断，同时排除除子痫前期外其他产科合并症与内外科合并症。选择标准：所有产妇均无其他产科合并症且为单胎妊娠，研究组产妇须符合子痫前期诊断标准。所有产妇均对研究干预知情同意并签署知情同意书。排除存在其他妊娠合并症、可影响胎盘淋巴细胞凋亡及CD44表达水平合并症产妇。所纳入的产妇中，研究组年龄范围（23～34）岁，平均年龄（28.76±3.59）岁，孕周数（37～40）岁，平均孕周数（37.97±0.93）周，对照组年龄范围（23～33）岁，平均年龄（28.31±3.62）岁，孕周数（37～40）岁，平均孕周数（37.84±0.73）周。两组一般资料无明显差异，P＞0.05，具有对比价值。本研究内容经我院伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.2.1 实验器材：淋巴细胞分离液（级别：BR，密度：1.077±0.002 g/ml，PH（25℃）：6.5～7.5）；一步法RNA抽提试剂盒（规格：500 ml/100 ml）；RT-PCR试剂盒（规格：P4251-100G）；全蛋白提取试剂盒（型号：BC3640-50T）。

1.2.2 操作方法：于产妇入院完成各项检查确定符合研究标准后进行外周EDTA抗凝血及胎盘母体面中央绒毛组织样本采集，采集完成后使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞备用。

CD44 mRNA表达水平检测方法：以RNA抽提试剂盒抽提总RNA并在Gene bank中查得CD44的基因系列，借助Primer 3.0软件进行引物与探针设计，采用RT-PCR通用试剂盒检测CD44的mRNA水平。

CD44蛋白水平检测方法：使用蛋白提取试剂盒提取淋巴细胞总蛋白，进行电泳凝胶的制备。电泳完成后切割胶条，转膜缓冲液平衡5 min，共3次。提前剪裁胶条同面积的滤纸与NC膜，放入转膜液中持续10 min。按照顺序安装转膜装置，量NC膜、凝胶与滤纸精准对齐，清除旗袍并加压500 g物品，碳板中多余液体予以吸干。接通电源后以1 mA/cm2的横流转移1.5 h，完成后取模取待测膜条进行免疫印迹法。将有蛋白标准的条带进行染色，50 s后在进行脱色，双蒸水清晰，风干并在两层滤纸间保存。免疫反应：洗膜（0.01M PBS，5 min/次，共3次），加包被液于室温环境下平稳摇晃2 h。扔去包被液再洗洗膜，5 min/次，共3次。加入CD44单抗，使用0.01M PBS稀释至合适比例并覆盖膜，4℃温度条件下放置＞12 g。阴性对照将一抗替换为1%BSA，余下步骤同实验组。0.01M PBS分别洗膜，5 min/次，共4次。加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（同上稀释法），室温下平稳摇动2 h。弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5 min/次，共4次。加入显色液，避光状态下显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

淋巴细胞凋亡检测方法：染色：取约2.0×106淋巴细胞，加入适量的Annexin V-FITC和PI试剂，室温避光孵育30 min，加入预冷的PBS液离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分，采用1%的多聚甲醛溶液重悬细胞。流式细胞术：将上述染色后的细胞标本上流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率（凋亡细胞：PI阴性Annexin V阳性的细胞）。

1.3 统计学方法

所有数据经SPSS19.0处理，计量资料以均数±标准差（)表示，组间比较采用t检验；以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组产妇的胎盘淋巴细胞凋亡率与CD44表达水平对比

结果显示，研究组产妇的CD44表达水平与淋巴细胞凋亡率均高于对照组，两组差异有统计学意义（t=4.454，2.100）；P＜0.05，提示CD44表达水平与胎盘淋巴细胞凋亡率呈现正相关性，CD44水平与子痫前期的发生存在一定相关性，见表1。

表1 两组产妇的胎盘淋巴细胞凋亡率与CD44表达水平对比（） %

表1 两组产妇的胎盘淋巴细胞凋亡率与CD44表达水平对比（） %

组别研究组（n=30）对照组（n=30）t P胎盘淋巴细胞凋亡率15.72±2.24 13.24±2.07 4.454 0.000 CD44表达水平38.03±6.21 25.14±4.23 2.100 0.020

3 讨论

现有研究认为胎盘浅着床，血管重铸障碍、免疫异常、凋亡过度、滋养细胞浸润能力异常等与子痫的发生具有较强关联性［2］。正常妊娠的维持，有赖于胎儿母体间免疫平衡的建立与稳定，而这种平衡一旦失调，即可导致子痫前期的发生［3］。母胎界面的蜕膜内有绒毛外滋养层细胞、免疫细胞和蜕膜细胞组成的相互影响、相互制约的网络状免疫微环境。其淋巴细胞中，大颗粒淋巴细胞（NK）的比例高达45%，且处于特定的功能状态。CD44是最主要的淋巴细胞归巢受体，参与淋巴细胞的再循环，淋巴细胞活化及炎症反应，并在母胎免疫耐受中起重要作用。目前普遍认为，胎盘浅着床和血管重铸障碍是子痫前期发病的中心环节，而这两者都与细胞滋养细胞浸润能力降低有关［4］。淋巴细胞凋亡异常可导致母胎界面滋养细胞凋亡异常，致使细胞滋养细胞向子宫内膜侵入不良—“浅着床”和血管重铸障碍，继而导致子痫前期的发生。在张亚明［5］的研究中提出调节性T淋巴细胞水平较低，对Th1细胞增殖抑制力减小，从而促使Th1/Th2的平衡偏向Th1,使其不能对胚胎抗原产生免疫抑制保护作用，外周血中NK细胞升高影响滋养细胞的正常功能，产生血管重铸障碍从而促发子痫前期。这与本研究中子痫前期产妇的胎盘淋巴细胞凋亡率高存在一致性，免疫反应增强而淋巴细胞数量增多，凋亡增多，研究组产妇的CD44表达水平与淋巴细胞凋亡率均高于对照组，提示CD44表达水平与胎盘淋巴细胞凋亡率呈现正相关性，CD44水平与子痫前期的发生存在一定相关性。

综上所述，胎盘淋巴细胞凋亡率与CD44表达水平呈现正相关性，正常产妇的胎盘淋巴细胞凋亡率低且CD44表达水平低，CD44表达高水平在预测子痫前期中具有一定参考价值。