Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

李 谞，徐书琴，张 显，徐美娟，杨套伟，张惠玲，方海田，饶志明*

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.生物工程学院，江苏无锡214122；3.宁夏大学 农学院，宁夏 银川750021）

在利用微生物进行表达重组蛋白质的过程中，良好的分泌性能降低产品回收成本，是重组蛋白质能否进行工业生产的重要考量因素。为了满足工业生产的需求，科研工作者们通过基因工程手段建立了许多提高分泌的策略[1-3]。其中，枯草芽孢杆菌由于缺少细胞外膜而具有良好的分泌能力[4]，是分泌生物制品的理想宿主。同时，枯草芽孢杆菌还具有食品安全性[5]、基因信息清楚[6]、良好的生产技术和发酵基础等特性，因此被广泛应用于蛋白质、食品添加剂、抗生素的生物发酵制备当中。

在枯草芽孢杆菌中，根据分泌的蛋白质是否依赖信号肽，可以分为信号肽依赖的分泌途径和不依赖于信号肽的分泌途径。枯草芽孢杆菌中依赖信号肽分泌的途径又分为以下4种[7]：Sec分泌途径（General secretion pathway），原核微生物中主要的蛋白质分泌途径，该类信号肽的最典型特征是C端氨基酸序列为Ala-X-Ala（X代表任何氨基酸），由Ⅰ型信号肽酶切割；Tat分泌途径（Twin-arginine translocation pathway），其特征在于N端含有双精氨酸（RR/KR）二级结构；ABC转运途径（ATP-binding cassette transporter），ABC转运途径仅用于细菌素等分子的输出[8]；假菌丝蛋白质输出途径（Pseudophilin pathway），假菌丝蛋白质输出途径参与枯草芽孢杆菌细胞感受态的形成[9]。在枯草芽孢杆菌胞外蛋白质组中的113种被鉴定的蛋白质中，约有15%的蛋白质缺少信号肽但依然被分泌到胞外培养基中[2]。这些不依赖于信号肽的蛋白质分泌途径研究相对较少，其分泌机理尚无法完全解析，并且与经典分泌途径有所不同，因此该分泌途径被称为非经典分泌途径（non-classical protein secretion pathway）[10]。

L-天冬酰胺酶（L-Asparaginase，EC 3.5.1.1）能够通过水解L-天冬酰胺脱氨基形成L-天冬氨酸和氨[11]，其在医疗和食品行业中都具有重要的应用价值[12]。在医疗行业中，L-天冬酰胺酶能降解癌细胞代谢循环所必须的L-天冬酰胺，从而杀死癌细胞[13]。在食品行业中，L-天冬酰胺酶能通过分解潜在致癌物质丙烯酰胺的前体天冬酰胺来降低高温、油炸食品中的丙烯酰胺含量[14-15]。

在课题组此前的研究中[16]，我们已经在枯草芽孢杆菌中成功实现Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶的高产发酵，与此同时，我们发现部分该酶能被枯草芽孢杆菌分泌到胞外，基于此，作者分析鉴定了Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌途径，并通过添加信号肽及共表达分子伴侣的方式提高了其分泌水平。

1 材料与方法

1.1 实验材料

E.coli和B.subtilis穿梭质粒pMA5、克隆宿主E.coliJM109、表达宿主B.subtilis168：由作者所在实验室保存；限制性核酸内切酶、PrimeSTAR®HS DNA聚合酶和T4 DNA连接酶：购买自TaKaRa生物公司（大连，中国）；小型质粒快速分离试剂盒、DNA提取试剂盒和Mini DNA快速纯化试剂盒等：购自Sangon Biotech Co.，Ltd（上海，中国）；质粒同源重组试剂盒（ClonExpress®MultiS One-Step Cloning Kit）：购自Vazyme Biotech Co.（南京，中国）；其余试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 重组质粒的构建以作者所在实验室已构建含有Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶基因（pyasnase）的重组质粒pMA5-pyasnase为模板[16]，分别用引物F1&R1和F2&R2为模板分别克隆启动子PHpaII和pyasnase，见表1。将获得的启动子PHpaII和pyasnasePCR产物分别用EcoRI&Eco RV和EcoRV&HindIII限制性核酸内切酶进行双酶切，通过酶连的方式将启动子PHpaII基因和pyasnas分别酶连于pMA5多克隆位点Eco RI&Eco RV和EcoRV&HindIII之间。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别用引物F3&R3-F13&R13分别扩增信号肽基因SPphoD、SPLipA、SPwapA、SPywbN、SPYmaC、SPpel、SPyvbx、SPlipB、SPnprE。利用同源重组试剂盒将携带有启动子PHpaII和pyasnase同源臂的信号肽基因连接到PHpaII和pyasnase之间。嗜麦芽寡养单胞菌脂肪酶信号肽SPlips基因由上海生工Sangon Biotech Co.，Ltd（上海，中国）合成并连接到PHpaII和pyasnase之间。以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用引物F12&R12和F13&R13扩增PrsA和DnaK，并用酶切酶连的方式连接到含有信号肽基因pMA5的BamHI&MluI间。将所得连接产物用热激法转入大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞，挑选阳性转化子，测序并检测是否构建成功，抽提质粒，将质粒转化入枯草芽孢杆菌Bacilus subtilis168感受态细胞中进行表达。

表1 引物序列表Table 1 Primers used in this study

1.2.2 L-天冬酰胺酶的表达和纯化将重组枯草芽孢杆菌接种至含有终质量浓度为20μg/mL的卡那霉素的LB培养基中（NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L），于37℃、200 r/min培养12 h，作为种子液。取1 mL该种子液接种在100 mL的新鲜发酵培养基（蔗糖35 g/L，蛋白胨15 g/L，尿素0.8 g/L，玉米浆12 g/L，K2HPO42.612 g/L，KH2PO42.041 g/L，MgSO4·7H2O 1.845 g/L，NaCl 5 g/L，L-天冬酰胺1 g/L）中，并在相同条件下培养24 h，将扩培后的重组枯草芽孢杆菌细胞于4℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液作为胞外粗酶液，用于胞外L-天冬酰胺酶酶活测定，并用Edman水解法降解，并用质谱进行蛋白质N端测序。取其细胞用裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0）重复洗涤细胞3次后，在细胞裂解缓冲液中加入6 mg/mL溶菌酶，4℃放置2 h，再于20 MHz、45%功率下，超声处理细胞30 min。将所得细胞裂解物在12 000 r/min下离心25 min，收集上清液作为胞内粗酶液，用于胞内L-天冬酰胺酶酶活测定。

1.2.3 L-天冬酰胺酶酶活的测定L-天冬酰胺酶酶活测定采用Li等人所述的奈斯勒试剂显色法进行，通过测定酶促反应所生成氨的量来计算酶促反应速率[16]。在95℃下对底物（1 mL的25 mmol/L L-天冬酰胺和50 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl混合物）进行预热后，加入100μL酶溶液，反应进行10 min后加入100μL 15%的三氯乙酸（TCA）终止反应。反应后的混合物体系以20 000 r/min离心10 min，取200μL澄清上清液加入4.8 mL去离子水中，并加入200μL奈斯勒试剂反应，用分光光度计在450 nm处测量吸光度来检测反应中释放的氨的量。对照组在酶促反应前加入100μL的15%三氯乙酸提前终止反应，以除去由于高温下L-天冬酰胺自水解带来的误差。酶活力单位定义：在酶的最适反应条件下，每分钟内产生1μmol氨所需的酶量定义为1个酶活单位。

2 结果与讨论

2.1 Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶分泌途径的鉴定

利用食品安全菌株枯草芽孢杆菌分泌L-天冬酰胺酶具有良好的食品应用前景[16]。Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶具有良好的热稳定性，在85℃下的半衰期达到105 min，37℃储藏1个月仍能保持90%以上的酶活，具有良好的应用潜能[17]。在此前的研究中，发现该酶在枯草芽孢杆菌中具有一定的分泌能力，摇瓶发酵24 h后，胞外和胞内酶活分别为23.31、65.72 U/mL，本研究对其分泌途径进行了分析鉴定。

SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线预测软件能准确的预测信号肽切割位点，进而对信号肽进行预测[18]。我们通过SignalP4.1 Server对该酶信号肽进行了预测，见图1。发现其整段氨基酸序列的切割位点值（C值）均较低，最高为0.213，未发现信号肽切割位点，说明该酶不具有典型的信号肽。同时，我们将胞外所得酶液体进行N端测序，发现分泌到胞外该酶N端序列（MRLLILGMG）与该酶蛋白N端初始氨基酸序列一致，说明该酶分泌过程中不存在信号肽的切割，再一次说明该酶的分泌不依赖于信号肽。

图1 P.yayanosii L-天冬酰胺酶信号肽预测Fig.1 Signal peptideprediction of P.yayanosii Lasparaginases

在枯草芽孢杆菌胞外蛋白质组中的113种被鉴定的蛋白质中，约有15%蛋白质缺少了典型的信号肽，但依旧被分泌到胞外[19]。对于这些“分泌蛋白”，一些学者们认为可能是由于细胞裂解所导致的[20]。为了验证该L-天冬酰胺酶的分泌是否由枯草芽孢杆菌裂解所致，我们监控了摇瓶发酵过程中胞外L-天冬酰胺酶的酶活情况，发现该酶在对数生长中期（发酵9 h）开始分泌，在稳定期胞外酶活也有所增加（图2（a））。稳定期间枯草芽孢杆菌生物量不变，胞外酶活的增加说明细胞持续分泌该L-天冬酰胺酶，但也有可能是由于细胞裂解速率与生物量增加速率相一致导致的。为排除细胞裂解的影响，我们在细胞对数生长期的后半段（发酵12 h）添加终质量浓度为100μg/mL的氯霉素，抑制枯草芽孢杆菌的生长，此后9小时枯草芽孢杆菌的生物量未降低，说明细胞未出现裂解，而此段时间内，该L-天冬酰胺酶在胞外酶活依旧持续增加，说明该L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌不是细胞裂解所引起的（图2（b））。综上所述，该L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌是由于不依赖信号肽的非经典非经典分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌的。

图2 Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶摇瓶发酵情况Fig.2 Shake flask fermentation of Pyrococcus yayanosii L-asparaginase

2.2 信号肽对L-天冬酰胺酶分泌的影响

为了提高Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶的分泌水平，我们研究了枯草芽孢杆菌来源的5种Tat途径的信号肽（SPphoD、SPLipA、SPwapA、SPywbN、SPYmaC）和4种Sec途径信号肽（SPpel、SPyvbx、SPlipB、SPnprE），以及1个嗜麦芽寡养单胞菌Sec途径信号肽SPlips对该酶分泌的影响。

将启动子PHpaII和L-天冬酰胺酶基因pyasnase分别连接到pMA5的EcoRI&Eco RV和EcoRV&HindIII酶切位点中，并利用同源重组将各信号肽基因连接到启动子和pyasnase之间，构建新的重组质粒（图3（a））。对胞外粗酶液进行酶活测定（图3（b）），并进行SDS-PAGE分析（图3（c）），发现Sec途径的信号肽对L-天冬酰胺酶的分泌都具有一定的抑制作用，Tat途径的信号肽对L-天冬酰胺酶的影响相对较小，其中SPphoD对该酶的分泌有一定促进作用，使该酶的分泌量从23.31 U/mL提高到30.03 U/mL，见表2。Sec途径分泌途径和Tat分泌途径的一个重要差异在于Sec途径分泌时先进行蛋白质分泌后再进行蛋白质折叠，而Tat途径分泌时蛋白质先折叠形成正确构象后再通过信号肽分泌到胞外[21]。可能由于该L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中迅速折叠，而Sec分泌途径的信号肽无法正确介导已折叠好的蛋白质进行分泌，反而由于在该L-天冬酰胺酶的N端加入一段短肽抑制了其自身的分泌特性从而降低了该酶的分泌能力。同时从表2可看出，在提高胞外酶活的同时并未造成胞内酶活的降低，这可能该酶在枯草芽孢杆菌细胞内有一个“阈值”，当该酶的量达到此“阈值”时，该酶难以再在细胞内积累，因此将酶分泌到胞外对提高该酶在枯草芽孢杆菌中的表达也具有重要的研究意义。

图3 信号肽介导的P.yayanosii L-天冬酰胺酶分泌型质粒的构建及其对酶分泌的影响Fig.3 Construction of secretion plasmid with signal peptide and effect to the secretion of P.yayanosii L-asparaginase

表2 信号肽对L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌的影响Table 2 Effect of signal peptides on L-asparaginase secretion with B.subtilis

2.3 共表达分子伴侣提高L-天冬酰胺酶分泌水平

分子伴侣（molecular chaperones）在细胞中能识别并结合到不完整折叠或装配的蛋白质，帮助这些蛋白质进行折叠、分泌。在枯草芽孢杆菌中，PrsA是一种能结合到胞质外侧的脂蛋白分子伴侣，在蛋白质分泌的过程中，它能协助蛋白质穿过细胞膜，因此与细胞的分泌水平紧密相关，提高PrsA的水平能使淀粉酶的分泌量提高6倍[22]。DnaK是一种胞内分子伴侣，它具有协调蛋白质折叠、减少蛋白质聚集、保护蛋白质前体转移的功能，该蛋白质的缺失会限制异源蛋白质分泌水平[23]。将PrsA和DnaK基因分别连接到含有pyasnase及SPphoD基因的pMA5质粒上的BamHI&MluI间（图4（a）），并将该重组质粒转入B.subtilis168中实现分子伴侣和该L-天冬酰胺酶的共表达，用以提高该酶的分泌水平。

图4 分子伴侣共表达表达质粒的构建及其对P.yayanosii L-天冬酰胺酶分泌的影响Fig.4 Co-expression plasmid construction of molecular chaperone and effect on the secretion of P.yayanosii L-asparaginase

取胞外粗酶液进行SDS-PAGE分析（图4（b））并进行酶活测定，发现该酶的分泌量在与DnaK共表达后并未出现明显变化（胞外酶活仅从30.03 U/mL变为30.15 U/mL，总酶活从96.15 U/mL变为96.25 U/mL），而与PrsA共表达后，成功的将胞外酶活从30.03 U/mL提高到40.12 U/mL，并且将蛋白质总的表达量从96.15 U/mL提高到105.4 U/mL。综合考虑不同途径信号肽及分子伴侣对该酶的影响，出现该结果可能是由于该酶的折叠较快，且不需要DnaK的协助或枯草芽孢杆菌中DnaK已足够满足该酶的折叠及转运的需求，同时由于其折叠较快且折叠好的分子相对较大，将蛋白质转出细胞膜成为限制该蛋白质分泌的重要因素，此时过表达PrsA，有利于该蛋白质的转出细胞膜，从而提高了该酶的分泌水平。

总体来说，通过添加Tat途径信号肽，并在此基础上共表达分子伴侣PrsA，使L-天冬酰胺酶分泌量从23.31 U/mL提高到40.12 U/mL，分泌量提高了72.11%。

3 结语

在本研究中，针对前期工作发现P.yayanosiiL-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中表达时具有一定分泌性的现象进行了研究。通过信号肽预测、N端测序等手段鉴定出P.yayanosiiL-天冬酰胺酶的分泌依赖非经典蛋白质分泌途径，并且发现Tat途径的信号肽SPphoD能提高该酶分泌水平，同时共表达分子伴侣PrsA有利于该酶的分泌，通过以上策略，将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%，并且对该酶的分泌过程进行了分析，为进一步研究和探讨该L-天冬酰胺酶的分泌过程及提高分泌能力提供了一定参考价值。