群体感应调控下的乳酸菌细菌素合成

宋 刚，曹春振，杨志馨，潘 月，葛菁萍*

（1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨150080；2.黑龙江大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨150080）

随着国民安全意识的不断提高以及国家对化学防腐剂的严格限制，利用新型、天然、安全的防腐剂代替传统防腐剂成为一种必然的趋势[1]。由乳酸菌产生的代谢产物——细菌素被认为是安全且天然的防腐剂，并且已成为主要关注点[2]。细菌素是一种由核糖体合成的抗菌蛋白质或多肽，可以抑制或杀死同种或种属关系较近的细菌[3]。现有由乳链球菌产生的乳酸链球菌素Nisin作为食品添加剂获得了FDA的认可并已经被投入使用[4]。目前，研究者们已经发现1 700多种细菌素，其中有300多种细菌素为乳酸菌产生[5]。

乳酸菌是一类被认为对人类安全的微生物，因此乳酸菌的代谢产物细菌素也被认为是对人类无害的，有望代替传统的防腐剂[6]。但是目前只有乳酸链球菌素Nisin通过了FDA认证并进行生产和使用，主要原因是大部分产细菌素乳酸菌的群体感应基因存在多样性，目前还没有一套通用的调控系统应用到细菌素的生产中，从而影响了乳酸菌细菌素的应用与发展[7]。

1 乳酸菌细菌素的分类

目前，研究者将细菌素分为3类：I类是含有羊毛硫氨酸的低相对分子质量（＜5 000）热稳定肽，含有约19～37个氨基酸，其主要结构含有氨基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸[8-9]，例如由乳酸乳杆菌属产生的乳链菌肽lactocin[10-11]。这些细菌素具有热稳定性，对革兰氏阳性菌如葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、李斯特菌和肠球菌的生长有着显著的抑制作用[12]。1944年Hirsch较早发现乳酸链球菌可产生一种具有抑菌活性的物质，且具有和蛋白质相似的结构和性质，后命名为Nisin，它是I类乳酸菌细菌素的典型代表[13]。II类是小相对分子质量（＜10 000）非羊毛硫氨酸热稳定肽，包括4个亚类IIa、IIb、IIc和IId，如 pediocin PA1、lactococcin G、acidocin B、lacticin Q等[14-15]；其中IIa类细菌素是主要的亚种，植物乳杆菌产生的pediocin PA1是主要代表。2014年Perez和其他研究者发现，IIa类细菌素仅对革兰氏阳性菌如乳酸菌和李斯特菌表现出抗菌活性[16]；2015年O′Oconnor等又发现IIa类细菌素对极少数革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等也具有抗菌活性[17]。III类为高相对分子质量（＞30 000）不含羊毛硫氨基酸的热不稳定肽，如lysostaphin、enterolysin A、helveticin J[15]。

表1 乳酸菌细菌素的分类Table 1 Classification of lactic acid bacteria bacteriocin

2 细菌素合成相关的群体感应系统

群体感应（QS）是细胞之间的通信过程，可以调节细菌之间细菌行为和调节基因表达的机制[18]。当信号分子达到阈值时，它使用可在细胞间扩散的信号分子来感知菌群的数量变化，启动其相关基因表达并调节相关的生物学功能[19]，如生物发光、生物聚类、细胞外多糖的合成、毒素和细菌素的产生以及生物膜的形成[20-22]。乳酸菌属于G+细菌，其QS系统与G-细菌不同。大部分乳酸菌有两套QS系统，分别应用于种内交流和种间交流[23]。

2.1 种内群体感应系统

在种内交流机制中，乳酸菌能够在核糖体中合成一种小分子寡肽类物质（autoinducingpeptide，AIP）的前导肽，其经过特殊的转录后加工与修饰成为具有活性的信号分子AIP，并通过对双组分蛋白质的磷酸化及去磷酸化级联反应进行信号传递，以达到对基因表达的调控作用[24]。不同种类的细菌中前导肽的长短及组成差异较大，形成的寡肽分子也不同[25]。此外，AIP不能自由通过细胞壁，需通过ATP结合盒转运蛋白（ABC）或其他膜传递蛋白质在细胞外分泌，从而行使功能作用[26]。乳酸菌的种内群体感应机制见图1。

图1 乳酸菌的种内群体感应机制Fig.1 Intraspecific quorum sensing mechanism of lactic acid bacteria

2.2 种间群体感应系统

LuxS/AI-2型QS系统又称种间QS系统，广泛存在于G-菌和G+菌中，研究人员认为，AI-2在细菌群体的交换中充当通用信号分子，在诸如肠道菌群等多菌种生态环境中发挥着重要的信号传递作用[27]。AI-2于1993年首次被人们认可，Bassler等人[28]在研究哈维氏弧菌（Vibro harveyi）生物发光现象时，发现负责调控的信号分子是AI-2，并详细探明其调控机制。

目前，已知大多数细菌中AI-2的生物合成途径基本相似，并且在细菌的基因组中都有发现luxS同源序列的存在[29]。AI-2由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）通过3步酶促反应形成。多细胞生物如真菌中的主要细胞甲基化供体也是合成脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白质的重要辅助因子呋喃硼酸二酯的前体[30]。在催化过程中，SAM被转化为甲基供体，形成中间产物S-腺苷同型半胱氨酸（Sadenosylhomocysteine，SAH），随后被SAH核苷酸酶水解为S-核糖高半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH）和腺嘌呤，由luxS基因编码的LuxS蛋白催化SRH产生高半胱氨酸和4，5-二羟基-2，3-戊二酮（4，5-dihydroxy-2，3-pentanedion，DPD），最后DPD进一步环化、重排及一系列反应形成AI-2[31]。由于4，5-二羟基-2，3-戊二酮从不同细菌中重排的差异，所以产生的AI-2具有一定的特异性，能够被不同的细菌所识别[32]。

LuxS蛋白是合成AI-2的关键酶，一些研究也证明了AI-2产生必须依赖luxS基因的表达调控，对luxS基因进行突变、克隆，致使LuxS蛋白失活，在细菌内也不能检测到AI-2的产生[33]。近来，研究发现一株从人类健康肠道中分离出的L.rhamnosusGG能够产生类似呋喃酰硼酸二酯类化合物的信号分子，并在该菌中发现了LuxS同源蛋白质，当敲除基因luxS后，致使突变菌株生长缓慢，且无法再合成细菌素的同时生物膜合成也受到阻碍[34]。

3 QS对乳酸菌细菌素产生的特性研究

3.1 QS对乳酸菌细菌素合成的调控

初步研究发现，群体感应系统可调节乳酸乳球菌、植物乳杆菌和球形乳杆菌中的细菌素合成[35]。目前，许多研究已经证实，大多数乳酸菌的细菌素合成受QS系统调控，如分别由乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、 嗜 酸 乳 杆 菌（Lactobacillus acidophilus） 和 嗜 热 链 球 菌（Streptococcus thermophilus）分泌的Nisin、ABP-118和Blp等均由QS系统进行调控[36]。其中，乳酸乳球菌分泌的细菌素——乳链菌肽（Nisin）是研究最多的，Nisin前体被修饰并转运到细胞外，当它作为信号分子达到阈值时，Nisin被双组分信号转导系统识别，最后开始表达编码细菌素的相关基因。当组氨酸蛋白激酶NisK或反应调节蛋白NisR被破坏时，Nisin不能合成[37]。当编码Nisin前体结构基因nisA突变后，菌株无法合成Nisin[38]。有趣的是，在培养基中再加入少量乳链菌肽后，突变菌株恢复了合成乳链菌肽的能力，这一现象说明乳链菌肽具有抗菌活性的同时还能诱导自身的合成，即具有自诱导肽功能。随后又发现乳链菌肽的抗菌活性高，自诱导肽活性低，且是相对独立的[39]。Renye JA等人[40]研究显示，嗜热链球菌ST109产生的细菌素是一种约5 000～6 000的热稳定肽，属于QS诱导肽，当编码群体感应诱导肽的blpC的缺失会导致抗微生物活性的丧失。Wayah SB等人[41]从椰子奶源里的戊糖乳杆菌CS2中分离出一种新型细菌素Pentocin MQ1，其生物合成受群体感应机制的调节。它具有广谱的抗菌活性，并且在针对藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌的微摩尔浓度有效。它表现出高的化学、热和pH稳定性，但显示出对蛋白质水解酶敏感。贾芳芳等人[42]发现，植物乳杆菌KLDS1.0391合成细菌素plantaricin受到群体感应系统的调控，当细菌生长代谢中分泌的信号分子AI-2达到阈值时，则会被HK所识别并经磷酸化与去磷酸化级联反应传递给RR，使细菌素合成基因表达。

作者所在实验室基于自然和加菌两种酸菜发酵体系，对副干酪乳杆菌HD 1.7（Lactobacillus paracaseiHD 1.7）合成细菌素paracin 1.7的机制进行了研究。研究表明，外源添加副干酪乳杆菌HD 1.7的加菌发酵体系与白菜中自然存在的乳酸菌、大肠杆菌、肠膜明串珠菌等内生菌群间通过传递细菌素作为信号分子引发群体感应，以刺激细菌素的生成来完成种群调节，使主要的功能菌群乳酸菌的相对丰度能够随着发酵底物和发酵条件的变化始终占据优势地位。

进一步试验引入宏基因组学和转录组学分析酸菜发酵，在酸菜发酵这一特殊微生态体系中引入产细菌素和不产细菌素的乳酸菌两种干扰因素，研究复杂的各菌群时空分布，从DNA、RNA、酶3个层面互相印证，在天然发酵和加菌发酵条件下，探究微生物的时空分布并阐明干扰菌的加入对发酵体系原有群体效应的影响，分析优势菌菌群变化与群体效应的关系。

3.2 QS对乳酸菌共培养时细菌素合成的调控

在产细菌素的乳酸菌领域，已经有一些研究集中于共培养诱导的细菌素产生的特征，特别是这种相互作用的分子机制。细菌素诱导微生物与产生细菌素的微生物之间没有明显的关系，在某些情况下，AI-2的存在与共培养诱导的细菌素表型相关[43]。Maldonado等人[44]对Lactobacillus plantarumNC8进行纯培养时是无法合成细菌素的，但当其与革兰氏阳性菌的不同属特定菌株共培养后，如罗伊氏乳杆菌DSM 20016，唾液乳杆菌NCFB 2747，LactococcuslactisMG1363等都可以诱导植物乳杆菌素NC8（plantaricin NC8）的产生，特别是当与LactococcuslactisMG1363共培养时，细菌素合成显著提高，合成量高达2 560 IU/mL。MANLL等人[45]进一步研究发现，当L.plantarumKLDS1.0391与L.helveticusKLDS 1.9207共培养信号分子AI-2积累达到阈值时，它将被双组分调控系统中的组氨酸蛋白激酶识别，并且信号分子将被磷酸化或去磷酸化为诱导调节剂，最后编码细菌素的相关基因表达，合成细菌素。张筠等人[45]研究发现，通过外源添加信号分子AI-2可以诱导L.plantarumKLDS1.0391的细菌素合成，可显著提高L.plantarumKLDS 1.0391细菌素编码基因和群体感应相关基因的转录表达水平；同时，蛋白质组学研究结果表明，参与碳水化合物、脂肪、蛋白质代谢途径双组分调节的相关蛋白质的表达水平显著上调。葛菁萍等人[46]通过在不同细胞密度下接种副干酪乳杆菌HD 1.7（Lactobacillus paracaseiHD 1.7），确定了细菌素paracin1.7产生的阈值浓度为106 CFU/mL，基于这一特殊条件，以5种不同细胞密度的Lactobacillus paracaseiHD1.7分别与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（ATCC 117744）、大肠杆菌（ATCC 25922）、植物乳杆菌（ATCC 8014）、乳酸乳球菌（ATCC 11454）、酿酒酵母（ATCC 2601）进行共培养，结果表明与枯草芽孢杆菌的进行共培养后可以诱导更多的细菌素生成，继而又将枯草芽孢杆菌培养物上清液进行纯化洗脱，发现了几种15 000～45 000大小的多肽。因此，可以推定枯草芽孢杆菌培养物上清液中存在作为群体感应的信号分子才促进了细菌素paracin 1.7的合成。

综上所述，乳酸菌可通过自诱导或将某些特定菌株作为共培养环境中的刺激因素，启动乳酸菌的QS，从而调节细菌素的合成以实现高产率。由此也表明，QS在乳酸菌菌体生长、蛋白质表达及细菌素合成的过程中扮演着重要的角色。

4 展望

环境中普遍存在的乳酸菌，其作为细菌素安全可靠的来源已在食品工业中受到重视，尤其是AI-2在人为调节下细菌素合成量变化中的潜在作用。然而，群体感应作为一种环境变化响应机制，在不同环境条件下，会出现不同的响应，因此正向调控群体感应，掌控影响AI-2在细胞中的生成机制并实现利用，还需我们继续研究挖掘，以高效发挥乳酸菌细菌素对人类健康的推动作用。