络风宁2号方对心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能和心肌纤维化的影响

杨雪卿，王显

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多数心血管疾病难以避免的结局，已成为重大的公共健康问题[1]，CHF的主要病因是长期心脏负荷过重，引起心室重塑并发心功能障碍，而心肌纤维化主要参与了心室重塑的病理过程[2]。因此，现阶段寻找能延缓或阻止心肌纤维化及心室重构过程的治疗方法势在必行。

CHF属于中医“心衰病”的范畴，中医病机总属本虚标实，本虚为阳气亏虚，标实为水湿、痰浊、瘀血，故益气温阳、活血利水为其治疗大法[3]。近年来关于应用中医药治疗心衰心肌纤维化的研究越来越多，大量中医学者验证了益气、温阳、活血类中药方剂有减轻心肌纤维化、防止和延缓心室重构，并明显改善心功能的功效[4-6]。

北京中医药大学东直门医院王显教授提出了“络风内动”病机学说，认为气虚血瘀、阳虚水泛、络风内动、风水相搏是心衰病新的病机概括，创新性的提出了“益气温阳、活血利水、祛风通络”为治疗心衰病的基本大法，并依法研制出了治疗心衰病的协定处方-络风宁2号方[7-13]。前期研究中我们发现络风宁2号方治疗CHF患者取得了显著的临床疗效，并且对CHF心肌纤维化标志物产生了一定的影响[14-19]。本研究进一步探讨络风宁2号方对心肌梗死（心梗）后心力衰竭（心衰）大鼠心功能和心肌纤维化进程的影响及其可能的药理机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级12周龄健康雄性SD大鼠56只，体重为（200±20）克，购自河北医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2013-1-003，实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2011-0057，常温饲养，自由饮水，用标准合成大鼠饲料饲养，分笼饲养，每笼5只，大鼠笼具、饮水瓶定期清洗，消毒。

1.1.2 实验药物络风宁2号方由徐长卿、防己、鹿衔草、党参、炙黄芪、黑附子、桂枝、茯苓、炒白术、葶苈子等组成，均由北京中医医院顺义医院制剂室加工为颗粒剂。卡托普利片（开博通）：规格12.5 mg/片，国药准字：H31022986，中美上海施贵宝制药有限公司生产。

1.1.3 主要试剂及仪器masson染液、无水乙醇、苏木精、丽春红（国药集团化学试剂有限公司），NT-proBNP ELISA kit（SEA598）（北京益奥明科技有限公司）包埋机、病理切片机、组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司），正置光学显微镜（日本尼康生产），光学显微镜（奥林巴斯公司，型号：IX71），大鼠超声影像系统（加拿大VisualSonics公司，型号：Vevo2100），大鼠超声探头（加拿大VisualSonics公司，型号：MS250，频率范围是14～24 MHz），MultiSkan FC酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司），低速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司有限公司），漩涡混匀器（北京金北德工贸限公司）

1.2 方法

1.2.1 动物分组50只SD大鼠造模后，术后48 h内死亡7只，存活43只。测量心电图后剔除8只未成模的大鼠，剩余35只造模成功的大鼠，随机分为模型组7只，卡托普利组7只，络风宁2号方低剂量组7只，络风宁2号方中剂量组7只，络风宁2号方高剂量组7只。假手术组6只，造模完存活5只。后续因灌胃等意外，最终模型组6只，卡托普利组6只，络风宁2号方低剂量组6只，络风宁2号方中剂量组7只，络风宁2号方高剂量组6只，假手术组5只。造模手术存活率43/50×100%=86%，造模成功率35/50×100%=70%，假手术组大鼠存活率5/6×100%=83.3%。

1.2.2 造模模型组大鼠采用左冠状动脉前降支（LAD）结扎法[20,21]，术后进行心电图检测，心电图I导联ST段弓背向上抬高，同时肉眼观察结扎区域左室壁心肌变苍白为结扎成功标志；假手术组大鼠只在LAD穿线打一线圈，不结扎。术后8周经多普勒超声心动图检测，以左室射血分数（LVEF）≤45%作为心衰模型成功的标志[22]。

1.2.3 给药各组大鼠分别给药，具体给药方式，见表1。各组均连续灌胃4周。

表1 各组大鼠给药方式

1.3 检测指标

1.3.1 超声心动图检测心脏结构及心功能各组大鼠灌胃4周后进行超声心动图检查，每组原始数据取连续3个心动周期的平均值，检测指标包括同一心动周期的左室收缩末期内径（LVDs）、左室舒张末期内径（LVDd）、LVEF。

1.3.2 血清学指标N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）灌胃4周后，大鼠进行麻醉，腹主动脉取血，以3000 r/min离心10 min，取上清，置于-80℃冰箱中备检，采用ELISA法按试剂盒说明书检测大鼠血清中NT-proBNP 水平。

1.3.3 Masson染色和胶原容积分数检测每只大鼠选取左室中段横截面心肌，3张组织切片进行Masson染色，每张切片在明视野400倍视野下随机选取5个视野，采用Image-Pro-Plus6.0医学图像分析软件计算心肌胶原面积，胶原组织面积占所测视野面积的百分比即为胶原容积分数（CVF）。

1.4 统计学分析试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行处理，实验数据以均数土标准差（±s）表示，先进行正态性检验和方差齐性检验，满足正态分布的数据采用单因素方差分析做多组间均数比较，方差齐时采用LSD法做多重比较，方差不齐的数据采用Games-Howell法做多重比较；不符合正态分布的数据先进行对数转换成为符合正态分布的数据后，再用单因素方差分析做多组间均数比较；不能通过函数转换成正态分布的数据，采用非参数法Kruskal-Wallis H检验进行多组比较，组间多重比较的显著性水平采用校正的α’值（α’=0.05/两两比较次数）做统计学判断，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况各组大鼠具体一般情况（表2）。

2.2 各组大鼠超声心动图检测心脏结构及心功能变化药物干预4周后，大鼠左室扩大，整体心脏的收缩功能降低；与假手术组比较，模型组大鼠的LVDd、LVDs均升高（P＜0.05），LVEF显著降低（P＜0.05），提示造模成功；与模型组比较，卡托普利组、络风宁2号中剂量组和络风宁2号高剂量组大鼠LVDd均显著降低（P＜0.05），络风宁2号高剂量组LVDs降低明显（P＜0.05），其余各给药组无显著差异（P＞0.05）；与模型组比较，卡托普利组、络风宁2号中剂量组和高剂量组大鼠LVEF均显著升高（P＜0.05），络风宁2号低剂量组LVEF虽有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），（表3、图1）。

2.3 血清学指标NT-proBNP药物干预4周后检测大鼠血清NT-ProBNP水平，结果显示模型组较假手术组明显升高（P＜0.05）；卡托普利组、络风宁2号低、中、高剂量组血清NT-ProBNP明显低于模型组（P＜0.05）；与络风宁2号低剂量组相比，高剂量组及中剂量组NT-ProBNP明显降低（P＜0.05）；与络风宁2号中剂量组相比，高剂量组NT-ProBNP明显降低（P＜0.05），络风宁2号高剂量组和卡托普利组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表2 各组大鼠具体一般情况

表3 各组大鼠心脏结构和心功能比较（±s）

表3 各组大鼠心脏结构和心功能比较（±s）

注：LVDs：左室收缩末期内径；LVDd：左室舒张末期内径；LVEF；左室射血分数；与模型组比较，aP＜0.05；与假手术组比较，bP＜0.05

项目 假手术组 模型组 卡托普利组 络风宁2号低剂量组 络风宁2号中剂量组 络风宁2号高剂量组LVDd（mm） 5.81±0.78 7.27±1.83b 6.21±1.25a 6.51±1.42 6.21±1.25a 5.84±0.82a LVDs（mm） 2.84±0.83 6.06±1.24b 5.19±0.78 5.41±1.10 5.22±1.81 4.97±1.07a LVEF（%） 79.07±3.21 39.98±14.80b 51.49±14.94a 49.63±7.88 53.34±21.01a 53.95±11.59a

图1 各组大鼠超声心动图

表4 各组大鼠血清NT-proBNP水平的比较（±s）

表4 各组大鼠血清NT-proBNP水平的比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与假手术组比较，bP＜0.05；与卡托普利组比较，cP＜0.05；与络风宁2号低剂量组比较，dP＜0.05；与络风宁2号中剂量组比较，eP＜0.05

组别 例数 NT-proBNP（pg/ml）假手术组 5 167.73±8.45模型组 6 493.56±12.60b卡托普利组 6 198.93±7.34a络风宁2号低剂量组 6 322.37±8.07ac络风宁2号中剂量组 7 248.05±10.13acd络风宁2号高剂量组 6 218.45±9.15ade

2.4 Masson 染色和胶原容积分数检测药物干预4周后大鼠心肌Masson染色，大鼠肌红纤维呈红色，心肌纤维组织呈蓝色，结果显示假手术组细胞外仅有少量胶原，模型组出现大量胶原增生，药物干预组大鼠心肌细胞纤维化程度均低于模型组，而络风宁2号低剂量组与模型组相近，随着中药剂量的增加，胶原增生明显减轻，且卡托普利组和络风宁2号高剂量组胶原含量较模型组减少较明显。

CVF结果显示药物干预4周后，模型组CVF明显高于假手术组（P＜0.05）；卡托普利组、络风宁2号低、中、高剂量组CVF明显低于模型组（P＜0.05）；与络风宁2号低剂量组相比，高剂量组及中剂量组CVF明显降低（P＜0.05）；与络风宁2号中剂量组相比，高剂量组明显降低（P＜0.05），络风宁2号高剂量组和卡托普利组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）（表5）。

图2 各组大鼠心肌细胞胶原纤维表达比较（masson染色，400×）

表5 各组大鼠心肌胶原容积分数的比较（±s）

表5 各组大鼠心肌胶原容积分数的比较（±s）

注：CVF：胶原容积分数；与模型组比较，aP＜0.05；与假手术组比较，bP＜0.05；与卡托普利组比较，cP＜0.05；与络风宁2号低剂量组比较，dP＜0.05；与络风宁2号中剂量组比较，eP＜0.05

组别 例数 C V F（%）假手术组 5 5.7 3±0.2 1模型组 6 3 3.6 1±0.6 3 b卡托普利组 6 9.2 3±0.3 4 a络风宁2号低剂量组 6 2 1.5 7±0.1 7 ac络风宁2号中剂量组 7 1 4.0 0±0.1 3 acd络风宁2号高剂量组 6 1 0.6 1±0.2 8 ade

3 讨论

本研究通过大鼠冠状动脉结扎法制成心梗后心衰模型，从心功能和组织病理学角度观察络风宁2号对心衰大鼠心功能和心肌纤维化的影响。冠状动脉结扎法需要的实验条件和操作技术要求比较高，且可出现与人类相似的心肌纤维化病理改变，因此是目前较好的研究心衰或心肌纤维化的动物模型[24]。本实验造模后造模组大鼠均出现了蜷卧懒动或饮食减少或饮水减少或鼻唇紫绀或呼吸急促或鼠爪或鼠尾水肿等心衰的症状和体征，而假手术组大鼠无以上任何一项表现，进一步证明大鼠模型成功建立，可开展实验。

超声心动图是临床上评价心功能的常用客观手段，本研究结果显示造模8周后超声提示LVEF≤45%证明造模成功。各给药组LVDs、LVDd与模型组比较均明显降低，同时LVEF也有明显改善，提示应用药物治疗后大鼠的心功能得到改善，其中卡托普利组、络风宁2号高剂量组均显示了较好的治疗作用。

NT-proBNP水平可以反映出心脏舒张末期容量负荷和心功能情况，并可用于判断心衰严重程度[25]。近年有研究表明它可作为心肌纤维化早期诊断和严重程度的评估指标[26]。本研究结果显示模型组血清NT-proBNP均较假手术组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）说明模型组大鼠存在心衰，药物干预组血清NT-proBNP明显低于模型组（P＜0.01）说明卡托普利和络风宁2号方干预后可使心衰大鼠NT-proBNP表达下降，证明卡托普利和络风宁2号方可明显改善心功能；组间比较说明络风宁2号方改善大鼠心功能的作用和剂量呈正相关，且大剂量络风宁2号方和卡托普利改善CHF大鼠心功能的作用相当。

本研究中，采用Masson染色法来观察大鼠心肌纤维化程度，研究结果显示除假手术组外，模型组心肌间质胶原均明显增多，说明有明显的心衰心肌纤维化的改变；药物干预组胶原增生均较模型组少，且随着中药剂量的增加，胶原增生明显减轻；以卡托普利组和络风宁2号高剂量组较模型组减少较明显，说明卡托普利组和络风宁2号高剂量组均能抑制大鼠胶原增生且抑制作用较强；进一步分析CVF，同样证明了模型组大鼠心肌胶原明显表达，出现心肌纤维化改变；卡托普利和络风宁2号方的干预有效抑制了心肌纤维化的发展，组间比较则证明络风宁2号方抑制心肌纤维化的作用同剂量正相关，且络风宁2号高剂量组抑制心衰大鼠心肌纤维化的作用与卡托普利相比无明显差异。

王显教授创新性的提出了“络风内动”病机学说，前期大量的临床与基础研究己证实理论的合理性，我们将此病机理论在心衰领域中进行延伸，认为心衰病的治疗应在益气温阳、活血利水法的基础上，强调使用“风药”祛风通络，加强利水消肿的功效。我们在益气温阳、活血利水常规治疗心力衰竭的基础上，加用徐长卿、鹿衔草、防己等风药制成络风宁2号方，方中附子温通心肾之阳；桂枝温心阳、通血脉、利水湿；茯苓、白术、砂仁、木香、陈皮、檀香、清半夏，一则理气以消脉中之痰瘀，二则健脾以渗湿利水；党参、黄芪、丹参益气与活血相结合，可化瘀不伤正，使正气复，心络通；杏仁化痰平喘；葶苈子、泽泻利水消肿；风药徐长卿、鹿衔草、防己有轻扬之性，含芳香之气，能直接作用于心脉，振奋阳气、宣畅气机、利水消肿、活跃气血，方中药物谨守病机，各司其属，共奏益气温阳、活血利水、祛风通络之效。

本研究结果表明络风宁2号方有较好的改善心衰大鼠心功能和抗心肌纤维化的作用，且此作用在一定范围内同剂量呈正相关；本实验还发现高剂量络风宁2号方和卡托普利改善心肌纤维化大鼠心功能和抗MF的的作用相当，因此，我们推测络风宁2号方可能有和卡托普利相同的作用机制而改善心衰MF进程，这也许是今后深入研究的方向之一。