芪参益气滴丸对心脏后负荷增加大鼠不同阶段心脏全基因表达的影响

田国祥，姚璐，张薇，李彦川，马晓慧，魏万林，武云涛

作者单位：1 100700 北京,解放军总医院第七医学中心干四科;2 300410 天津,天士力研究院药理毒理研究中心;3 100700 北京,解放

我们课题组前期的研究已表明，后负荷增加的大鼠在不同的心力衰竭（心衰）阶段心脏全基因表达谱存在较大的差异[1]。中医研究认为，慢性心衰阶段属本虚标实、虚实夹杂之证，以心之气阳虚衰为本，血脉瘀滞、水饮内停、痰浊不化为标[2]，其基本治法应是：温阳、益气与利水化饮法等。而益气活血化瘀组方芪参益气滴丸是一种新型纯中药制剂，由黄芪、丹参、三七、降香配伍制成，具有益气通脉、活血止痛的功效，临床上已开始用于冠心病、心绞痛、心功能不全的治疗。前期临床及基础研究中观察到：芪参益气滴丸可降低急性冠脉综合征（ACS）患者经皮冠状动脉（冠脉）介入术（PCI）后血清炎症趋化因子的水平[3]；改善肾血管性高血压大鼠的心肌肥厚[4,5]；并且可改善心力衰竭（心衰）患者的症状及心功能指标等。为此，本项目研究了芪参益气滴丸对后负荷增加心衰大鼠不同时段段基因表达的影响，结果将有利于揭示其作用的物质基础和影响心脏基因表达的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组选择雄性SD大鼠，体重200～220 g，SPF级，110只。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。屏障动物房饲养，温度20～25℃，相对湿度40%～60%，每笼5只，自由饮食，每日更换垫料。110只大鼠，术前随机取10只进行处理（基线组，Basel组），相关参数作为基线数据；其余100只，随机分为假手术组（SHAM group，S组，30只），模型组（Model group，M组，30只）和芪参益气滴丸低剂量组（L组，20只）、芪参益气滴丸高剂量组（H组，20只）。其中模型组和假手术组有分别分为2周亚组、8周亚组、18周亚组，芪参益气滴丸组分为8周亚组、18周亚组，每个亚组包含10只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 心脏后负荷增加大鼠造模及给药方法采用缩窄腹主动脉的方法建立大鼠后负荷增加心衰模型，具体方法参见文献[1]。模型组及芪参益气滴丸高、低剂量组大鼠采用缩窄腹主动脉的方法建立心脏后负荷增加模型，假手术组大鼠腹主动脉只穿线不进行缩窄。芪参益气滴丸组大鼠造模术后2周开始每日给予芪参益气滴丸流浸膏灌胃处理，低剂量组大鼠给予150 mg/kg·d，高剂量组大鼠给予300 mg/kg·d。

1.2.2 大鼠心脏结构及血流动力学指标检测方法造模术前及术后2周、8周、18周采用小动物超声实时影像系统及颈动脉插管检测以下指标：左室舒张末压（LVEDP）、收缩期左心室内压上升的最大变化速率（+dp/dtmax），舒张期左心室内压下降的最大变化速率（-dp/dtmax），平均动脉压等，具体方法参见文献[1]。

1.2.3 大鼠心脏组织取材造模术前及术后2周、8周、18周，剖杀动物，快速取心脏、冲净、称重，取左心室，切成绿豆大，装入冻存管，放入液氮中保存。送北京诺和致源生物信息科技有限公司进行高通量测序。

1.2.4 大鼠心脏标本建库及全基因组测序流程由北京诺和致源生物信息科技有限公司按照图1所示步骤进行：①Total RNA样品检测；②文库构建；③文库质量检测；④上机测序。

1.2.5 大鼠心脏基因表达分析流程及差异基因的筛选所有样本均使用Illumina HiSeqTM2500/MiseqTM对文库进行高通量测序，具体由北京诺和致源生物信息科技有限公司按照图2所示步骤进行。其中基因表达水平对比：通过所有基因的RPKM（Reads Per Kilo bases per Million reads）分布图以及盒形图对不同实验条件下的基因表达水平进行比较。对于同一实验条件下的重复样品，最终的RPKM为所有重复数据的平均值。差异表达基因列表：基因差异表达的输入数据为基因表达水平分析中得到的readcount数据。对于有生物学重复的样品，采用DESeq进行分析。差异表达基因筛选：用火山图可以推断差异基因的整体分布情况，对于无生物学重复的实验，为消除生物学变异，从差异倍数和显著水平两个方面进行评估，对差异基因进行筛选，阈值设定一般为：|log2(FoldChange)| ＞1且qvalue＜0.005。对于有生物学重复的实验，由于DESeq已经进行了生物学变异的消除，对差异基因筛选的标准一般为：padj＜0.05。[log2FoldChange：log2(Sample1/Sample2)；Sample1：校正后样品1的readcount值；Sample2：校正后样品2的readcount值；log2FoldChange＞0为高表达，log2FoldChange＜0为低表达；pvalue(pval)：统计学差异显著性检验指标；qvalue(padj/p-adjusted)：校正后的pvalue，qvalue越小，表示基因表达差异越显著]。

图1 大鼠心脏标本建库流程图

图2 大鼠心脏基因表达高通量测序及差异表达分析流程图

1.3 统计学方法采用SPSS 15.0软件进行数据的统计学处理，计算各组动物的实验数据平均值及标准差，不同时间段多组间均数的比较采用方差分析，组间均数的比较采用q检验。P＜0.05被认为为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪参益气滴丸对后负荷增加大鼠不同时间点心脏重构及血流动力学的影响芪参益气滴丸低剂量组大鼠平均动脉压术后第8周、第18周较同时间段假手术组明显增加（P均＜0.05），较模型组降低，但无统计学差异（P＞0.05）；芪参益气滴丸高剂量组大鼠平均动脉压术后第8周、第18周较同时间段假手术组增加（P＞0.05），较模型组明显降低（P＜0.05）。芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组大鼠SV术后第8周、第18周较同时间段假手术组降低（P均＜0.05），较模型组显著增加（P＜0.05）；芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组大鼠左室射血分数（LVEF）术后第8周与同时间段假手术组比较无统计学差异（P均＞0.05），较模型组显著增加（P＜0.05），术后第18周较同时间段假手术组和模型组均明显增加（P＜0.05）。芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组大鼠左室重量术后第8周较同时间段假手术组明显增加（P均＜0.05），与模型组比较无统计学差异（P＜0.05）；芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组大鼠术后第18周与同时间段假手术组及模型组比较均无统计学差异（P＞0.05）。芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组大鼠左室舒张末内径（LVIDd）术后第8周与同时间段假手术组比较无统计学差异（P均＞0.05），芪参益气滴丸低剂量组LVIDd与同时间段模型组比较无统计学差异（P＞0.05）、高剂量组大鼠较模型组明显降低（P＜0.05）；芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组大鼠LVIDd术后第18周与同时间段假手术组比较无统计学差异（P均＞0.05），高剂量组大鼠LVIDd术后第18周较模型组明显降低（P＜0.05）。芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组大鼠LVEDP术后第8周、18周较同时间段假手术组明显增加（P均＜0.05），芪参益气滴丸低剂量组大鼠LVEDP术后第8周、18周与同时间段模型组比较均无统计学差异（P均＞0.05），芪参益气滴丸高剂量组大鼠术后第8周较同时间段模型组明显降低（P＜0.05）。芪参益气滴丸低剂量组大鼠BPM术后第8周、18周与同时间段假手术组及模型组比较均无统计学差异（P均＞0.05），芪参益气滴丸高剂量组大鼠BPM术后第8周、18周较同时间段假手术组及模型组明显降低（P均＜0.05）。芪参益气滴丸低剂量组大鼠Max dP/dt术后第8周、18周较同时间段假手术组明显降低（P均＜0.05），芪参益气滴丸低剂量组Max dP/dt术后第8周较同时间段模型组明显增加（P＜0.05）；芪参益气滴丸高剂量组大鼠Max dP/dt术后第8周与同时间段假手术组比较无统计学差异（P＞0.05），较同时间段模型组增加（P＜0.05），术后第18周较同时间段假手术组明显降低（P＜0.05），较同时间段模型组明显增加（P＜0.05）（表1）。表明后负荷增加可引起大鼠心脏发生显著的心肌重构及血流动力学变化，而芪参益气滴丸能够改善后负荷增加大鼠血流动力学及心脏重构。

2.2 不同时间和组别大鼠心脏差异表达基因数量比较

2.2.1 芪参益气滴丸组与基线大鼠心脏差异表达基因数量芪参益气滴丸低剂量组（L组）、高剂量组（H组）大鼠在造模术后第8周与基线时全基因表达差异表达基因的个数增高，分别为2050、1710个基因，至第18周差异表达的基因个数回落，分别为1741、1558个基因。造模术后第8周芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组与基线差异表达基因个数较同时间点模型组与基线差异表达基因个数有显著下降，其中芪参益气滴丸高剂量组下降更显著。术后第18周芪参益气滴丸低剂量组、高剂量组较基线差异表达基因个数回落，与同时间段模型组相似，但都高于假手术组（表2）。

2.2.2 芪参益气滴丸组与模型组2周亚组大鼠心脏差异表达基因数量芪参益气滴丸低剂量组（L组）大鼠在第8周（L_8W）、第18周（L_18W）较模型组2周亚组（M_2W）差异表达的基因个数呈降低趋势，分别为2011、1557个基因。芪参益气滴丸高剂量组（H组）大鼠在第8周（H_8W）、第18周（H_18W）较M_2W亚组差异表达的基因个数呈升高趋势，分别为1183、1554个基因。结果显示，与M_2W亚组比较，芪参益气滴丸低剂量组（L_8W）及高剂量组（H_8W）尤其是高剂量组心脏基因表达差异基因数量较模型组8周亚组（M_8W）显著降低，而术后18周时，芪参益气滴丸低剂量组（L_18W）心脏基因表达差异基因数量下降幅度小于模型组（M_18W），高剂量组（H_18W）差异基因数量甚至升高（表2）。

表1 不同时间点大鼠心脏结构及血流动力学相关指标比较（每组n=10）

2.2.3 芪参益气滴丸组术后8W、18W与同时间段模型组心脏基因表达比较差异基因数量术后8周，芪参益气滴丸低剂量组（L_8W）、高剂量组（H_8W）大鼠，较模型组（M_8W）差异表达的基因个数分别为46、78个基因；术后18周，芪参益气滴丸低剂量组（L_18W）、高剂量组（H_18W）大鼠，较模型组（M_18W）差异表达的基因个数分别为52、32个基因。结果显示，术后第8周，与模型组M_8W心脏基因表达比较，芪参益气滴丸高剂量组（H_8W）差异表达基因数量高于芪参益气滴丸低剂量组（L_8W），而术后18周时，芪参益气滴丸高剂量组（H_18W）与模型组（M_18W）比较差异基因数量迅速下降（表2）。

表2 不同时间和组别大鼠心脏差异表达基因数量比较

2.3 芪参益气组大鼠心脏差异表达基因及功能通路分析

2.3.1 术后8周时，芪参益气滴丸组与模型组心脏差异表达基因造模术后8周时，芪参益气滴丸组（H_8W、L_8W）与模型组（M_8W）大鼠心脏差异表达的基因个数分别为78、46个基因，其中重复基因9个，因此差异基因总个数为115个，具体差异基因名称及基因表达情况如图3。

2.3.2 术后18周时，芪参益气滴丸组与模型组心脏差异表达基因造模术后18周时，芪参益气滴丸组（H_18W、L_18W）与模型组（M_18W）大鼠心脏差异表达的基因个数分别为32、52个基因，其中重复基因10个，因此差异基因总个数为74个，具体差异基因名称及基因表达情况如图4。

图3 8W时芪参益气滴丸组与模型组大鼠比较心脏差异表达基因（横坐标为差异基因，纵坐标为log2FoldChange）

图4 18W时芪参益气滴丸组与模型组大鼠比较心脏差异表达基因（横坐标为差异基因，纵坐标为log2FoldChange）

2.3.3 芪参益气滴丸高剂量组与模型组不同时间段心脏差异表达基因在造模术后8周、18周，芪参益气滴丸高剂量组（H_8W、H_18W）与同时间点模型组（M_8W、M_18W）大鼠心脏差异表达的基因个数分别为78、32个基因，其中重复基因5个，因此差异基因总个数为105个，具体差异基因名称及基因表达情况如图5。

2.4 芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠心脏差异表达基因功能通路分析

2.4.1 两组大鼠心脏不同时间点差异表达基因GO富集柱状图基因本体（Gene Ontology，GO）分为生物过程（biological process）、细胞组成（cellular component）以及分子功能（molecular Function）三个部分。通过差异基因GO（Gene Ontology，GO）富集柱状图，可直观观察到芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠心脏在造模术后第8周和第18周时在生物过程、细胞组分和分子功能富集的GO term上差异基因的个数分布情况（图6）。从图6a中可以看出，造模术后第8周，芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠差异基因主要集中于生物过程中的离子转运、化学刺激反应、金属离子运输以及分子功能中水解酶活力、结合功能等。从图6b中可以看出，造模术后第18周，芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠差异基因相对分散，主要集中于分子功能中的催化活性、肽酶活性、细胞骨架蛋白结合等。

图5 芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠比较心脏差异表达基因（横坐标为差异基因，纵坐标为log2FoldChange）

图6a H_8W vs. M_8W

图6b H_18W vs. M_18W

2.4.2 两组大鼠心脏不同时间点差异基因KEGG富集分析结果KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系统分析基因功能、基因组信息数据库一种工具。从图7a中可看出，造模术后第8周，芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠差异基因主要富集于昼夜节律、甘油磷脂代谢等通路中；从图7b中可看出，造模术后第18周，芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠差异基因主要主要富集于HIF-1信号通路中等。

图7a H_8W vs. M_8W

图7b H_18W vs. M_18W

3 讨论

在中医传统文献中并无“心力衰竭”之名，根据其临床特征，主要涉及中医“喘证”、“水肿”、“心悸”、“怔忡”、“痰饮”、“心痹”等范畴。多数研究认为，慢性心衰阶段属本虚标实、虚实夹杂之证，以心之气阳虚衰为本，血脉瘀滞、水饮内停、痰浊不化为标[2]。其基本治法应是：温阳、益气与利水化饮法。中医认为，黄芪每能益气，可以补肺气、益正气、升阳气，心衰病人应用黄芪，一是水肿明显时，取黄芪有益气行水之功，二是有气虚血瘀时，取黄芪有益气行血之功。中医理论“气为血之帅，血为气之母”，概括“气”与“血”的关系。气血都是构成人体生命活动的基本物质，“气为血之帅”包括气能生血，气能行血。“血为气之母”是指血为气之载体，血能生气。二者互根互用，相互依存。益气活血化瘀组方芪参益气滴丸是一种新型纯中药制剂，由黄芪、丹参、三七、降香配伍制成，具有益气通脉、活血止痛的功效，临床上已开始用于冠心病、心绞痛、心功能不全的治疗。我们课题组前期临床及基础研究中观察到：芪参益气滴丸可降低ACS患者PCI后血清炎症趋化因子的水平[3]；改善肾血管性高血压大鼠的心肌肥厚[4,5]；并且可改善心衰患者的症状及心功能指标。目前利用基因芯片技术研究心衰的基因表达谱已见报道[6,7]，但用其研究中医药对心衰相关基因谱差异表达的干预影响的研究较少见。

本项目采用缩窄腹主动脉的方法建立大鼠心脏后负荷增加模型[8,9]，前面的研究已经显示模型组大鼠平均动脉压显著上升、心脏重构及心功能进行衰退，而假手术组大鼠血流动力学及心脏结构无显著变化，因此通过缩窄腹主动脉建立的心脏后负荷增加大鼠模型造模成功[1]。本次研究中进一步观察了益气活血化瘀中药芪参益气滴丸对后负荷增加大鼠心脏和血流动力学的影响，结果显示芪参益气滴丸能够改善后负荷增加大鼠心脏每搏输出量、LVEF、+dp/dtmax，减小平均动脉压、LVIDd、左室舒张末压，从而改善大鼠心脏血流动力学及心脏重构。

本研究显示，芪参益气滴丸组大鼠在造模术后第8周较基线时心脏全基因谱差异表达基因的个数呈升高趋势，至第18周差异表达的基因个数回落。造模术后第8周芪参益气滴丸组与基线时差异表达基因个数较同时间点模型组与基线差异表达基因个数有显著下降，其中芪参益气滴丸高剂量组下降更显著。另外，与模型组M_2W亚组心脏基因表达比较，芪参益气滴丸低剂量组（L_8W）及高剂量组（H_8W）尤其是高剂量组心脏基因表达差异基因数量较模型组8周亚组（M_8W）显著降低，而术后18周时，芪参益气滴丸低剂量组（L_18W）心脏基因表达差异基因数量下降幅度小于模型组（M_18W），高剂量组（H_18W）差异基因数量甚至升高。术后第8周，与模型组M_8W亚组心脏基因表达比较，芪参益气滴丸高剂量组（H_8W）差异表达基因数量高于芪参益气滴丸低剂量组（L_8W），而术后18周时，芪参益气滴丸高剂量组（H_18W）与模型组（M_18W）比较差异基因数量迅速下降。以上结果表明，益气活血化瘀中药芪参益气滴丸在术后8周和18周，可引起造模大鼠心脏基因表达谱的显著变化，从而引起心肌细胞、基质细胞结构和功能的巨大变化，这可能是大鼠心脏血流动力学及心脏重构变化的基础。

本研究中，还对芪参益气滴丸组与模型组大鼠心脏差异表达基因功能通路进行了分析。其中基因本体（Gene Ontology，GO）富集柱状图显示，造模术后第8周，芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠差异基因主要集中于生物过程中的离子转运、化学刺激反应、金属离子运输以及分子功能中水解酶活力、结合功能等；造模术后第18周，芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠差异基因相对分散，主要集中于分子功能中的催化活性、肽酶活性、细胞骨架蛋白结合等。另外，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析结果显示，造模术后第8周，芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠差异基因主要富集于昼夜节律、甘油磷脂代谢等等通路中；造模术后第18周，芪参益气滴丸高剂量组与模型组大鼠差异基因主要主要富集于HIF-1信号通路中等。

综上，本研究初步显示，益气活血化瘀中药芪参益气滴丸可以改善后负荷增加大鼠心脏血流动力学及心脏重构，可能与药物引起造模大鼠心脏基因表达谱的显著变化，导致心肌细胞及基质细胞等生物过程、细胞结构、分子功能等一系列信号通路的变化有关，但具体的信号通路还有待于进一步的深入研究。