提前复苏D3胚胎对不同年龄段患者临床结局的影响

李玉虎，于萍，李宁，蔡雪想，张留光

(海口玛丽医院生殖医学中心，海口 570100)

胚胎冷冻及复苏技术已经成为最重要的辅助生殖技术衍生手段之一，它可以使患者在更合适的时期接受胚胎移植，提高累积妊娠率。影响冻融胚胎移植(FET)周期临床妊娠率的因素主要包括：患者年龄、胚胎质量、冷冻方法、内膜厚度、移植胚胎数目及胚胎与内膜发育的同步性等[1-4]。近年来有关提前复苏卵裂期胚胎(D3胚胎)是否有助于提高胚胎着床率和临床妊娠率的观点仍存在争议。有研究者认为提前复苏冷冻胚胎有助于提高临床妊娠率[5-7]，但也有研究者持反对意见[8-9]。之前的研究多集中于提前复苏与当日复苏之间的比较，而忽略了年龄因素对妊娠结局的影响。因此，本研究对本中心不同年龄段患者提前复苏移植周期和当日复苏移植周期的妊娠结局进行回顾性分析与比较，探讨提前复苏胚胎对不同年龄段患者妊娠结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2015年5月至2018年3月在本中心行FET助孕治疗的581个周期的临床资料，其中154个自然周期，427个人工周期，共复苏1 267枚胚胎，移植1 267枚。

纳入标准：选择女方因盆腔、输卵管、排卵障碍等因素不孕，男方少、弱、畸精子症、无精子症等因素不育，以及不明原因致不孕不育的FET周期；排除移植单个卵裂期胚胎，女方子宫内膜异位症、宫腔粘连等影响着床因素的FET周期。

二、研究方法

1.分组：将纳入研究的FET周期按照不同的胚胎复苏时间分为两组：当日复苏的为A组，提前18 h复苏的为B组；又按照女方年龄不同分为3个年龄段组：≤35岁、36～40岁和>40岁，比较不同年龄各组中A、B两组的妊娠结局。

2.冷冻与复苏：采用玻璃化冷冻和解冻试剂盒(Kitazato，日本)进行胚胎的冷冻与复苏，冷冻与复苏步骤严格按照本中心常规操作和试剂盒说明书进行。在室温条件下，将胚胎放在ES液面上，让其自然下沉，大约7 min后将胚胎转入VS液中，在不同位置吹吸，最后将胚胎转移到玻璃化冷冻载杆上(Kitazato，日本)并迅速投入液氮中保存，胚胎从转入VS液到投入液氮中的时间间隔不超过1 min(50～60 s)。复苏时，将载体从液氮中取出并迅速浸入提前37℃预热的TS液中，1 min后将胚胎转移至DS液，3 min后转入WS1液，5 min后转入WS2液，5 min后再转入含10%人血清替代品的培养基中(Quinn’s 1029，SAGE，美国)，在37℃、6%CO2及5%O2的培养箱中培养。提前复苏的胚胎大约培养18 h，当日复苏的胚胎大约培养2 h。

3.内膜准备：根据患者自身条件不同，内膜准备方案分为自然周期和人工周期两种。自然周期适用于月经期规律的患者，于月经第10天开始B超监测卵泡发育情况及内膜厚度，综合LH、E2及孕酮(P)水平确定排卵时间[10]，排卵后第3天进行胚胎移植。人工周期适用于排卵障碍、月经不规律、自然周期内膜发育欠佳者，从月经周期第2～3天起口服戊酸雌二醇(补佳乐，先灵，德国)，根据B超监测内膜厚度酌情调整戊酸雌二醇剂量，至内膜≥8 mm时肌肉注射黄体酮(浙江仙琚制药，40～60 mg/d)转化内膜，3 d后移植。两种内膜准备方案的授精方式既有体外受精(IVF)也有卵胞浆内单精子注射(ICSI)，之后在B超引导下进行胚胎移植。所有FET移植周期冷冻复苏胚胎均为优质D3胚胎(D1～D2发育正常，D3卵裂球数目为7～9个，卵裂球大小均匀或大致均匀，碎片<20%)且复苏后无损伤。

4.妊娠判断及观察指标：胚胎移植第14天测定血清β-HCG值，>25 U/L为生化妊娠；第35天行阴道超声检查示宫内有孕囊者为临床妊娠。孕囊数≥2个为多胎妊娠。B超随访有胎心搏动者为继续妊娠，无胎心搏动者为早期流产。

观察指标：胚胎着床率=孕囊数/移植胚胎数×100%，临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，多胎率=多胎周期数/临床妊娠周期数×100%，流产率=流产胚胎数/着床胚胎数×100%。

四、统计学分析

结 果

一、各组患者一般资料比较

纳入研究的581个FET周期，共复苏1 267枚胚胎，移植1 267枚，平均移植(2.2±0.4)枚胚胎；患者平均年龄(35.9±5.2)岁，平均不孕年限(5.7±4.4)年，平均内膜厚度(9.6±1.6)mm。581个周期中当日复苏的共233个周期，提前18 h复苏的共348个周期。各不同年龄组之间的自然周期比例、平均年龄、内膜厚度、原发不育比例、ICSI比例和平均移植胚胎数比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组患者的基本特征比较[(±s)，n(%)]

二、各不同年龄组中A、B两组的妊娠结局比较

与A组比较，B组的整体胚胎着床率(33.9% vs. 22.3%)、临床妊娠率(54.0% vs. 42.1%)和多胎率(32.4 vs. 18.4%)显著升高(P<0.05)。各不同年龄组中，≤35岁组中B组的胚胎着床率(47.3% vs. 31.1%)、临床妊娠率(68.3% vs. 53.0%)和多胎率(43.6% vs. 20.8%)显著高于A组(P<0.05)；36～40岁组中，B组的胚胎着床率(30.3% vs. 19.1%)和临床妊娠率(53.2% vs. 36.5%)显著高于A组(P<0.05)，但两组的多胎率(20.7% vs. 22.6%)比较无显著性差异(P>0.05)；>40岁组中，A组和B组的胚胎着床率、临床妊娠率和多胎率比较均无显著性差异(P>0.05)。各不同年龄组中A、B组间的流产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组患者FET临床结局的比较(%)

注：与同组中A组比较，*P<0.05，**P<0.01

讨 论

胚胎冷冻与解冻方法、解冻后胚胎质量、患者年龄、移植时子宫内膜厚度及同步性是影响FET结局的重要因素[1-4，11]。对于提前复苏冻融胚胎是否能提高FET周期的种植率和临床妊娠率，目前尚有争议，原因可能与研究的样本量大小、样本纳入标准、胚胎冷冻方法及患者年龄分布等有关。另外，也可能与各生殖中心对移植时期的选择，即子宫种植窗与胚胎发育同步性的评估有关。以前研究多集中于提前复苏与当日复苏之间的比较，而忽略了年龄对着床率及妊娠结局的影响。

因此，本研究对本中心不同年龄段患者提前复苏移植周期和当日复苏移植周期的妊娠结局进行了回顾性分析与比较，结果显示：在平均年龄、内膜厚度、内膜准备方案、原发不孕比例、ICSI比例和平均移植胚胎数均无统计学差异的情况下，提前18 h复苏D3卵裂期胚胎能显著提高胚胎着床率、临床妊娠率和多胎率；在患者年龄≤40岁的两个FET组中，提前复苏D3胚胎能显著提高胚胎着床率和临床妊娠率，随着年龄的升高，胚胎着床率和临床妊娠率明显下降。当患者年龄>40岁时，两组之间的着床率和临床妊娠率无显著性差异，提前复苏不能提高胚胎的种植潜能。提前复苏D3胚胎能显著提高≤35岁组患者FET周期的着床率，从而引发多胎率的升高，高达43.6%。多胎妊娠的母婴并发症，如：妊娠高血压综合征、胎儿宫内发育迟缓、低体重儿、流产、早产及胎膜早破、胎儿畸形、双胎输血综合征、羊水过多、羊水栓塞、胎盘早剥及产后出血等[12]的发生率较单胎妊娠高数倍，减少移植胚胎数是降低多胎妊娠的关键因素。有研究表明，卵裂期冻融胚胎经过夜培养后，卵裂球恢复程度高或有融合细胞阶段的胚胎，能获得更好的种植率和妊娠率[13]。因此，对年龄≤35岁患者的FET周期，可选择移植单个生长较好或融合阶段的胚胎，以降低多胎妊娠的发生。

解冻胚胎移植时机的选择也是FET是否成功的重要因素之一，只有当胚胎发育与子宫内膜同步时才有可能妊娠。研究表明，提前解冻发育相对较慢的胚胎(4～6个细胞)，可获得理想的妊娠率[14-15]。对于发育速度相对慢的胚胎，如果在移植日当天解冻，子宫内膜发育的速度可能较胚胎快，导致胚胎与内膜的发育不同步，从而降低胚胎的着床率。而提前复苏发育速度相对慢的胚胎可使胚胎与子宫内膜的发育相对同步，从而提高胚胎的着床率。本研究发现提前复苏D3正常发育速度的优质胚胎，其着床率也较当日解冻胚胎显著提高。其原因可能为：部分解冻胚胎透明带偏硬或发育潜能差的胚胎需要较长时间从透明带中孵出，而过夜培养能提供相对长的时间使囊胚孵出并着床于同步的子宫内膜；体外培养的胚胎发育落后于体内发育，而复苏的胚胎具有一段时间的静止期，提前复苏有利于调整胚胎与子宫内膜发育的时间差，使两者尽可能达到同步化，实现成功着床；提前复苏可能使囊胚提前孵出，使胚胎与子宫内膜窗口期有相对长的接触时间，种植率也可能提高。

提前复苏D3胚胎不能改善40岁以上患者FET周期的妊娠结局，原因可能为高龄患者卵巢功能减退，卵子质量和数量下降，造成获卵数和可用胚胎数减少，且高龄女性容易发生胚胎染色体异常，导致胚胎发育潜能差、妊娠率低和流产率高，提前复苏也不能改善40岁以上患者胚胎种植率低的事实[1]。此外，高龄女性卵子中的氧自由基增加，引起卵子线粒体数量和功能的异常，使得受精卵的非整倍体率增加、胚胎发育潜能下降及子宫内环境相对较差等，导致自然流产率增高[16]。本研究结果也显示，随着年龄的增加自然流产率也随之增高，>40岁患者的流产率达50%左右，提示改善高龄患者的临床结局是辅助生殖技术领域所面临的挑战。

综上所述，提前复苏D3胚胎不增加FET周期的流产率；提前18 h复苏D3胚胎可显著提高年龄≤40岁患者FET周期的着床率和临床妊娠率，对年龄>40岁的患者则无明显影响；同时提前复苏能显著提高年龄≤35岁患者的多胎率，提示临床工作中应减少这部分患者FET周期的移植胚胎数，以获得理想的临床结局。