转化医学学会《男性不育症精子DNA碎片检测临床实践指南》解读
2020-03-19高庆和晏斌刘煜刘胜京付建华
高庆和，晏斌，刘煜，刘胜京，付建华
(中国中医科学院西苑医院，北京 100091)
精液分析是评估男性生育能力的基础检查，包括精液体积、精子浓度、精子存活率、前向运动精子百分率以及精子形态学分析等，检测结果可为临床医生提供初步的诊断依据[1]。但精液分析不能准确预测由于精子质量变化而产生的影响，因此有必要寻找其他的检测指标，来提高男性生育的预测和管理[2]。随着对男性不育症病因及机制的深入研究，精子DNA碎片(Sperm DNA fragmentation，SDF)检测可能成为评价男性生育能力的重要手段，精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index，DFI)开始为患者的病因诊断提供新依据。虽然其在男性不育症的临床诊断中并未常规使用，但SDF检测的价值已被美国泌尿外科学会和欧洲泌尿外科学会的相关指南承认。转化医学学会(The Society for Translational Medicine，TSM)在2017年发表了《男性不育症精子DNA碎片检测临床实践指南》(以下简称《指南》)，介绍了SDF的检测方法、SDF检测适应症、DFI结果分析等[3]。本文通过对《指南》进行解读，旨在指导临床医师和检验人员规范SDF的检测和应用，尤其是对DFI结果的客观分析。
一、SDF的检测
《指南》指出，精子DNA损伤的机制尚不清楚，存在多种SDF检测方法。在实验室中广泛使用并将其作为临床指标应用于男性生育评估之前，需要在方法学上对SDF检测进行规范，实现SDF检测的标准化。
1.SDF的检测方法：SDF检测一般分为直接和间接检测两类方法。直接测定法通过直接使用探针和染料来测量。间接测定法既测量现有的断裂，也可以测量DNA对变性的敏感性。目前SDF检测有8种方法[4]，其中末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)、精子染色质结构分析(SCSA)和精子染色质弥散试验(SCD)是3种最常用的检测方法。(1)TUNEL：利用荧光标记的核苷酸片段检测DNA的“Nicks”或游离端，该方法通过使用流式细胞术或荧光显微镜对dUTP通过酶反应进入单链或双链DNA断裂进行定量。(2)SCSA：基于流式细胞术的检测方法，用于评估吖啶橙色染色到DNA断裂的大量细胞，在精子DNA的温和酸变性之后，核酸选择性阳离子荧光染料与产生绿色荧光的双链DNA或产生红色荧光的单链DNA结合，DNA变性的程度是通过测量从绿色到红色荧光的异色移位来确定的。(3)SCD：也被称为光晕测试，即具有片断DNA的精子在酸变性和去除核蛋白后不会产生在具有非片断DNA精子中观察到的分散DNA环的特征光晕，利用显微镜去观察光晕的有无和大小从而判断精子DNA的完整性。不管使用哪种检测方法，研究表明SDF检测在评估精子DNA损伤和生育潜力方面具有重要价值[5]。
2.SDF的检测要求：文献报道新鲜精液最常用于SDF检测(表1，C级建议)，加工处理后的精液会对检测结果有一定影响。体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)的精子制备程序会造成精子DNA损伤。密度梯度离心法(DGC)是辅助生殖技术(ART)前一种常见的精子制备程序，虽然DGC使得精子活动率改善，但DGC后精子DFI从15%显著增加到25%[6]，从而导致较低的妊娠率[7]。但也有研究得出相反的观点，显示在DGC后DNA受损的精子比例减少了22%～47%[8]。此外，精子细胞上游(swim-up)后，精子SDF与受精率、着床率和妊娠率之间并没有明显的相关性[9]。因此，精液处理对SDF的影响尚不确定，需要进一步的研究，目前的证据尚不支持在SDF检测中使用处理后的精液来预测ART结局。
3.禁欲时间对SDF结果的影响：采集精液标本前的禁欲时间对SDF结果有一定影响(表1，C级建议)。与禁欲时间较长的患者相比，禁欲1 d的SDF显著降低，缩短禁欲时间已被建议作为治疗高SDF的一种方法[10]。虽然最佳的禁欲时间尚未确定，《指南》建议在精液采集前2～3 d禁欲可能会减少SDF个体内和个体间差异对测试结果的影响。与正常对照组相比，具有高SDF的不育男性精液样本中活性氧(ROS)含量较高[11]。《指南》推荐缩短精子培养时间、在室温下保存以及向培养基中添加抗氧化剂/低温保护剂等策略以减少对SDF的影响。
4.SDF检测的标准化：具有严格质量控制的标准方案对于SDF检测结果的可靠性是必不可少的(表1，B-C级建议)。目前，SDF检测的不足之处即DNA损伤的性质和类型是未知的。但通过反映样本的整体质量和精子DNA的性质，这些测试是相互关联的，并且可能指向共同的损伤来源。研究显示，当使用相同的仪器在标准化的分析条件下独立分析同一组精液样品时，两个实验室之间的SDF结果具有高度相关性[12]。同样，经验丰富的技术人员使用标准化方案对精液样品SDF进行比较测量，也显示出实验室之间高度可靠的结果[13]。同时，流式细胞术的应用允许在相对较短的时间内分析数千个细胞，大大增加了SDF检测的可靠性[14]。与其他技术中使用光学或荧光显微镜相比，TUNEL和SCSA中流式细胞术的加入减少了观察者内和观察者间的变异性。在SDF检测中，SCSA、TUNEL、SCD和彗星实验(COMET Assay)具有文献报道的标准化方案[15-18]。因此，SDF检测的标准化，需要在专业实验室通过标准方案和质量控制才能确定检测的可靠性。
表1 SDF的检测要求
二、SDF检测的临床适应证
尽管精子DNA完整性在人类生殖中的重要作用已被广泛研究，但SDF检测的临床适应证尚不明确，《指南》根据现有证据支持的试验，在临床实践中为SDF检测提出具体的适应证。
1.精索静脉曲张患者：精索静脉曲张是男性不育的常见原因，精索静脉结扎术已被证明能显著改善精液参数，改善自然妊娠结局[19]。使用传统的精液分析作为手术治疗获益与否的评价指标是不足的[20]，在发现SDF与精索静脉曲张显著正相关后，人们开始关注SDF检测，关注精索静脉曲张患者的SDF数值。在包括16个病例对照研究的文献综述中，Zini等[21]指出精索静脉曲张男性的SDF高于对照组，表明精索静脉曲张与DNA损伤有关。Esteves等[22]的一项多中心研究评估各种病因的SDF，发现男性精索静脉曲张患者SDF发生率最高[(35.7±18.3)%]。精索静脉曲张与SDF之间的相关性，在精索静脉结扎术后精子DNA损伤改善中得到进一步验证。Zini等[21]报道12项研究中共511例患者精索静脉结扎术后SDF降低。有Meta分析表明，精索静脉结扎术提高了精子的完整性，与未治疗相比平均差异3.37%[95%CI(-4.09，-2.65)，P<0.000 01][23]。
SDF与临床2～3级精索静脉曲张之间的关系得到了各种研究的证据支持，Sadek等[24]报道，只有3级精索静脉曲张患者术后SDF有统计学上的显著降低。Ni等[25]报道，手术修复后2级和3级精索静脉曲张患者的SDF均减少。因此，SDF检测推荐用于常规精液参数正常的2～3级精索静脉曲张患者(表2，C级推荐)。然而，目前还没有足够的证据来证明SDF检测在低度精索静脉曲张中的临床应用，因此需要进一步的研究来阐明SDF在1级精索静脉曲张中的应用价值。一项研究评估了482例1～3级的精索静脉曲张不育症患者，术后精液参数均有统计学意义的改善，而且低度精索静脉曲张患者在手术后获得了与3级精索静脉曲张患者相似的自然妊娠结局[26]。因此，《指南》推荐SDF检测用于精液参数临界或异常的1级精索静脉曲张患者(表2，C级推荐)。
SDF与精索静脉曲张之间具有相关性，以及精索静脉曲张患者术后SDF改善，支持SDF检测在精索静脉曲张患者中应用。SDF检测在2～3级精索静脉曲张患者中的应用较为明确，在1级精索静脉曲张患者中的应用仍需进一步的研究。
2.不明原因不育、宫腔内人工授精(IUI)失败或反复流产的患者：不明原因不育症约占不育夫妇的10%～30%[27]。男性因素可能存在精子DNA完整性受损，而精液参数正常[28]，这也证明传统精液分析的局限性。有25%～40%精液参数正常的不育男性出现DFI大于20%～30%。Olezczuk等[29]将119名不明原因不育症的男性与95名已证实生育能力的男性进行比较，发现不明原因不育症患者DFI在30%以上的为17.7%，而已证实生育能力的男性为10.5%(P=0.005)。SDF与IUI失败相关，Duran等[30]评估154个IUI周期的精液样本，在IUI失败的周期中SDF水平明显升高。Bungum等[28]研究称，DFI>30%的患者生化妊娠(3% vs. 24%)、临床妊娠(3% vs. 23.7%)和分娩率(1% vs. 19%)较DFI<30%的患者显著降低。SDF与反复流产相关，Carlini等[31]发现尽管精液参数正常，反复流产组DFI[(18.8±7.0)%]高于生育对照组[(12.8±5.3)%]，与不育夫妇相似[(20.8±8.9)%]，反复流产事件数与DFI升高呈显著正相关(r=0.20，P<0.05)。因此，不明原因不育、IUI失败和反复流产的夫妇应该进行SDF检测，同时实施可能的干预措施来减少DFI(表2，C级建议)。
3.IVF和/或ICSI失败的患者：SDF与IVF妊娠率之间具有显著关系，Zini等[32]评估了9项IVF研究，发现高SDF患者的妊娠率较低，合并优势比为1.57[95%CI(1.18-2.07)，P<0.05]；未发现SDF和ICSI妊娠率之间的显著关联，合并优势比为1.14[95%CI(0.86-1.54)]。Zhao等[33]在2 756对夫妇的荟萃分析中发现，高SDF患者IVF妊娠率较低，但ICSI妊娠率没有明显影响，这可能与ICSI过程是将精子直接注入卵母细胞，精子受到较少的氧化应激有关，同时质量较好的卵母细胞可能更有能力修复精子中的损伤。接受IVF和ICSI的患者，SDF与活产率之间具有相关性，有荟萃分析显示，低SDF的男性活产率高于高SDF的男性[OR=1.17，95%CI(1.07-1.28)，P=0.000 5][34]。另有研究显示低SDF的男性活产率明显较高，IVF和ICSI风险比分别为1.27[95%CI(1.05-1.52)，P=0.01]和1.11[95%CI(1.00-1.23)，P=0.04][35]。
在ART之前SDF检测常规应用存在争议，这与治疗策略对ART结局的不确定影响有关，但支持对高SDF患者进行干预的有效性证据仍在不断发展。Bradley等[36]发现睾丸抽吸精子的活产率(49.8%)、卵胞浆内形态选择后精子注射的活产率(28.7%)和生理性ICSI活产率(38.5%)高于未干预组(24.2%)。在ICSI中使用从睾丸获得的精子是一种合理的策略，这与精子DNA损伤发生在附睾运输过程中有关[37]。研究证明，高SDF、少精子症或反复IVF失败的男性中，采用睾丸取精是有益的(表2，B-C级建议)。
《指南》建议，SDF检测适用于反复出现辅助生殖失败的患者，在IVF或ICSI中的检测应该更早(表2，C级建议)。自然妊娠和ART可以通过SDF检测来预测结局，反复流产和ART失败与SDF升高有关。SDF检测的结果可为不育夫妇选择成功率高的ART方案提供依据。
4.具有危险因素的男性患者：SDF检测应提供给具有危险因素(主要指吸烟、肥胖等)的男性不育症患者，无论精液参数是否正常(表2，C级推荐)。氧化应激诱导的SDF与男性不育症患者的生活方式有潜在关系，通过改变这些危险因素，男性SDF检测值可以改善。(1)吸烟：吸烟对常规精液参数、精子受精能力和不育风险有不利影响[38]。Elshal等[39]研究显示，不育吸烟者的SDF显著高于不吸烟者。SDF程度与精液参数恶化之间存在显著的负相关。(2)肥胖：肥胖与生育能力低下有关，体重指数(BMI)增加和生育能力之间具有相应关系[40]。Kort等[41]评估了520对不育夫妇，发现男性BMI与SDF呈正相关，平均SDF从BMI正常男性的19.9%上升到肥胖男性的27.0%。因此，SDF检测应该对具有危险因素的不育男性提供。SDF与生活方式之间的关联使SDF检测成为识别高危患者和监测干预反应的理想工具，SDF检测也有助于督促患者生活方式的改变。
表2 SDF检测的适应证
注：根据证据质量给出的建议等级：A级，基于质量良好且与至少一个随机试验一致的临床研究；B级，基于设计良好的研究(前瞻性，队列)，但没有良好的随机临床试验；C级，基于质量较差的研究(回顾性，病例系列，专家意见)。修改自牛津循证医学中心。
三、SDF阈值的作用
SDF阈值可反映生殖结局的概率(表1，B-C级建议)，缺乏SDF检测的标准值是其不足之处。由于生殖涉及男女双方的多种因素，SDF阈值不能完全评估生殖结局。目前DFI实验室参考值一般如下：DFI≤15%表示精子DNA完整性好；15%
四、讨论
《指南》指出，随着ART的快速发展，男性不育症患者可以通过ICSI繁衍后代，却没有解释引起男性不育症的原因，忽视了对男性生育能力的评估。因此，过去几十年男性不育症的研究人员转向了精子内部的检测，发现精子DNA完整性对人类生殖具有重要作用[43-44]。
SDF能否被视为影响男性生育能力的一个独立致病因素，SDF检测是否应作为一项常规检测用以评价精子质量和预测男性生育能力仍然具有争议，但是针对SDF的大部分研究都清晰表明，SDF与人类生殖存在密切联系，SDF目前在临床中的可用性越来越高。《指南》对临床医师提出了具体的建议，SDF检测适应于精索静脉曲张、不明原因不育或IUI失败或反复流产、IVF和/或ICSI失败、生活方式具有危险因素的男性不育患者。同时，《指南》对SDF检测的规范性给出了具体要求，在精子采集和质量控制等方面确保SDF检测的准确性。
精子的产生是一个多因素参与协调的漫长过程，任何过程受到干扰或者损伤都有可能使精子DNA染色体结构异常，因此SDF产生的具体机制尚不明确。为减少异常SDF对生育的影响，口服抗氧化剂、精索静脉曲张修复、缩短禁欲时间、精子选择技术以及睾丸抽吸精子用于ICSI的尝试都取得了不同程度的进展。因此，SDF检测应与传统精液分析一起用于男性不育症的评估中，进一步的研究有助于SDF检测在临床实践中发挥的更大作用。
