常规IVF完全/部分受精失败后行早期补救ICSI的应用

王雪莹，谢聪聪，姚冠峰，郭晓丽，张丽，张玉，刘效群

(河北省计划生育科学技术研究院，河北省生殖医院，国家卫生健康委员会计划生育与优生重点实验室/河北省生殖医学重点实验室，石家庄 050071)

随着辅助生殖技术的迅速发展，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)临床治疗方案和胚胎实验室技术也日益完善，但是仍然无法避免在传统IVF治疗中完全受精失败(TFF)或受精率低的风险[1]。受精失败的解决办法目前只有两个，对于短时受精失败或者受精率低的可以在受精4～6 h实施早期补救卵胞浆内单精子注射(R-ICSI)，对于常规的隔夜受精失败可以实施晚期补救ICSI(L-ICSI)。有研究表明，由于L-ICSI胚胎发育潜能较低和子宫内膜异步化，其妊娠结局相对较差[2]。故L-ICSI可能不是TFF的最佳选择。

R-ICSI是在受精4～6 h观察第二极体排出的情况，对于TFF采取挽救性ICSI。众所周知，卵母细胞的质量会随着时间的延长而下降，对于TFF的患者R-ICSI是一个有效的补救办法，能获得更好的妊娠结局[3]。短时受精不仅可以通过R-ICSI有效地避免TFF，缩短精卵共孵育时间，也有助于消除精子和颗粒细胞代谢降解产物对卵母细胞潜在的负面作用，避免卵子老化，提高胚胎发育潜能，保证胚胎种植与内膜发育的同步性[4]。受精4～6 h早期机械性的剥除吸附的卵丘细胞，观察卵子第二极体排出，可能影响胚胎发育潜力[5]。考虑到卵母细胞损伤的潜在风险和额外费用的增加，未将常规ICSI技术作为非男性因素不孕患者的主要受精方法。短时受精联合R-ICSI可有效避免不明原因或原发不孕以及不孕时间较长的患者出现TFF或受精率低的情况。因此，本研究探讨短时受精联合R-ICSI在IVF失败和低受精周期中对胚胎发育潜能和临床妊娠结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2012年1月至2017年12月在本医院生殖中心行IVF-ET治疗的2 811个周期的临床资料。根据受精情况将患者分为3组：R-ICSI组：IVF周期中，受精4～6 h后，观察第二极体排出情况，对于受精6 h后第二极体排出率低于30%者实施R-ICSI(共210个周期)；常规IVF组：常规体外短时受精(共2 062个周期)；ICSI组：直接进行ICSI(共539个周期)。

二、研究方法

1.促排卵方案：采用常规促排卵方案，主要有长方案、拮抗剂方案、微刺激方案以及高孕激素状态下促排卵方案等。结合血清性激素水平和B超监测卵泡发育情况，当1～2个卵泡直径≥18 mm或者3个及以上卵泡直径≥17 mm时，注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)，35～36 h后取卵，卵母细胞常规实验室培养2～6 h。

2.精液处理和受精：男方禁欲3～7 d，取卵日手淫取精，待精液完全液化充分混匀后根据精子计数、浓度、活力予以密度梯度离心联合上游法或简单洗涤处理精液。在覆盖矿物油的培养基行常规IVF，将处理后精子密度调至2×105/ml，HCG后40 h左右受精；行ICSI者，用透明质酸酶去除颗粒细胞，HCG后40 h左右行ICSI。

3.受精情况：我中心均执行短时受精，无隔夜受精孵育者。IVF组：IVF后4～6 h去除卵母细胞周围的颗粒细胞，置于培养液微滴中观察第二极体的排出情况。R-ICSI组：对于受精6 h后第二极体排出率低于30%者，或者成熟卵母细胞均未排出第二极体者，行R-ICSI。直接ICSI组：取卵后1～2 h给予透明质酸酶剥除卵母细胞周边颗粒细胞，对于所有MⅡ卵母细胞行ICSI。

4.胚胎发育：IVF受精后18～20 h观察原核，见到双原核且看到两个极体为正常受精。受精后第3天根据卵裂球均匀度、碎片比例和发育速度等进行胚胎质量评估。Ⅰ级：8～10细胞；卵裂球大小均匀、形态规则，透明带完整；胞质均匀清晰；胚胎内碎片<5%。Ⅱ级：≥6细胞；卵裂球大小略不均匀、形态略不规则；胞质可有颗粒现象；胚胎内碎片5%～15%。Ⅲ级：D3≥4细胞；卵裂球大小不均匀、可有形态不规则；胞质可有粗颗粒现象；胚胎内碎片16%～25%。Ⅳ级：卵裂球大小极不均匀；胞质有严重粗颗粒现象；胚胎内碎片>30%；或存在多核现象。Ⅰ级和Ⅱ级为优质胚胎；Ⅰ～Ⅲ级为可利用胚胎。胚胎利用率(%)=(Ⅰ级+Ⅱ级+Ⅲ级胚胎数)/受精数×100%。

5.观察指标及妊娠判断：观察指标包括平均获卵数、移植胚胎数、MⅡ率、受精率、2PN率、优胚率、着床率、临床妊娠率等。其中MⅡ率=成熟卵子数/获卵数×100%，IVF组受精率=受精数/获卵数×100%，R-ICSI和ICSI组受精率=受精数/MⅡ数×100%，2PN率=2PN数/受精数×100%，多PN率=多PN数/受精数×100%，优胚率=优胚数/受精数×100%，可利用胚率=可利用胚数/受精数×100%，着床率=着床妊娠囊数/移植胚胎数×100%，临床妊娠率=临床妊娠周期数/(新鲜移植周期数+解冻移植周期数)×100%。

妊娠判断：移植后14 d测血和尿β-HCG阳性为生化妊娠，第28天B超见孕囊确诊为临床妊娠。

三、统计方法

结 果

一、患者一般情况比较

3组患者的平均年龄比较无显著性差异(P>0.05)。R-ICSI组原发不育比例显著高于IVF组(P<0.05)，但与ICSI组比较无显著性差异(P>0.05)。R-ICSI组的继发不育比例显著低于IVF组(P<0.05)，与ICSI组比较亦无显著性差异(P>0.05)。IVF组和R-ICSI组中女方因素不育比例显著高于ICSI组(P<0.05)，IVF组和R-ICSI组中男方因素不育比例显著低于ICSI组(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般资料的比较[(±s)，n(%)]

注：与IVF组比较，*P<0.05；与R-ICSI组比较，#P<0.05

二、实验室指标及妊娠结局的比较

3组患者的平均获卵数、移植胚胎数及MⅡ率比较均无显著性差异(P>0.05)。R-ICSI组患者的受精率显著高于IVF组和ICSI组(P<0.05)；R-ICSI组患者的2PN率显著低于ICSI组(P<0.05)，但与IVF组比较无显著性差异(P>0.05)；R-ICSI组的多PN率显著高于ICSI组，显著低于IVF组(P<0.05)；R-ICSI组的优胚率、可利用胚胎率及临床妊娠率均显著低于IVF组和ICSI组(P<0.05)；R-ICSI组的着床率显著低于IVF组(P<0.05)，但与ICSI组比较无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 患者实验室指标和妊娠结局的比较[(±s)，%]

注：与R-ICSI组比较，*P<0.05

讨 论

受精是一个复杂的过程，包括精子获能、精子与卵母细胞复合体的相互作用、精子与透明带的结合、顶体反应、精子与卵母细胞融合、卵母细胞激活和原核形成等重要环节。在此过程中，体外培养环境的任何变化都可能影响受精过程和胚胎发育。目前辅助生殖领域的促排卵方案和胚胎实验室技术不断完善，但常规IVF过程中仍不能完全避免TFF[6]。

之前研究表明，受精4～6 h后，观察第二极体排出情况，对没有排出第二极体的卵母细胞，采用R-ICSI会获得较好的妊娠结局[7-8]。史鸿志等[9]的研究结果显示，在受精后4 h，观察到第二极体的卵母细胞中，93.3%的卵母细胞和隔夜受精情况没有显著差异。提示短时受精可以作为一种评估早期受精发生的方法，同时为有效补救未受精卵提供了机会。然而对TFF或受精率低的周期进行R-ICSI会大大增加实验室的工作量。常规IVF中任何一个环节的异常都可能导致受精失败，ICSI可克服某些常规IVF受精失败的因素，提高受精率，但是ICSI过程中可能会损伤卵子，且ICSI跳过了正常受精对精子活力的自然筛选的过程，可能会将染色体异常的精子注射到卵子中，遗传给子代[10]。所以，受精方式的选择仍然需要谨慎。

我们的结果显示R-ICSI组原发不孕的比例显著高于常规IVF组，但与直接ICSI组比较无显著性差异，这与之前的研究结果[11]一致。Dodds等[12]的研究也表明，原发不孕患者TFF的风险较高，而不明原因不孕患者TFF的发生率可高达17.6%～25%。其发生可能与一些潜在原因有关，包括受精缺陷、内分泌紊乱、免疫/遗传和生殖生理缺陷、透明带硬化或减数分裂紊乱等[13-16]。

短时受精的安全性和有效性目前仍存在争议。短时受精与隔夜受精相比，清除卵母细胞周围的颗粒细胞更加困难。卵母细胞在受精早期由于纺锤丝和微管活跃变得更加脆弱，重复的吹吸卵母细胞可能会对卵母细胞结构的完整性造成不利影响，从而降低其对多精的防御能力[5]。然而，Zhang等[17]的分析表明，与隔夜受精比较，短时受精可以提高临床妊娠率和胚胎种植率。有文献报道常规IVF多PN受精的比例一般为2%～30%[18-19]，我们的结果显示R-ICSI后的多PN率为4.82%，高于ICSI组(1.49%)，但低于IVF组(8.58%)，和林碎玲等[20]报道的8.03%大体一致，但高于王巍等[21]报道的6.04%。异常受精率有所升高可能与HCG日E2值较高、HCG日直径≥14 mm的卵泡率低、获卵数多、成熟卵母细胞数多及精子优化后浓度高和活动率高有关，也可能是由于精卵共孵育后部分已受精的卵母细胞第二极体排出延迟，此时再行R-ICSI，可能导致多PN形成。我们将进一步总结数据，分析多PN产生的原因。

综上，本研究结果显示，IVF完全/部分受精失败后行R-ICSI的2PN率、优胚率、可利用胚率及临床妊娠率都有明显升高。提示常规IVF受精失败及低受精的患者行早期R-ICSI可有效克服受精障碍，显著提高受精率，且不影响胚胎的发育潜能，可获得良好的妊娠结局。因此，在IVF-ET周期中可以通过短时受精联合早期R-ICSI技术，改善TFF和低受精率患者的临床结局。