辅助生殖中外科取精术所获精子的处理与选择

孙超，高永超，李爱莉，王晶，丁旭，黄艳红*

(1.空军军医大学第一附属医院妇产科生殖医学中心，西安 710032；2.兵器工业卫生研究所药理毒理学研究室，西安 710065)

1992年，卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)获得首例活产为男性不育患者带来希望，使用附睾和睾丸的精子可以帮助男性不育患者拥有后代，是一场前所未有的技术革命。无精子症，临床上分为梗阻性无精子症(OA，约占40%)和非梗阻性无精子症(NOA，约占60%)[1]。OA多通过附睾穿刺，如显微附睾精子抽吸术(MESA)或经皮附睾穿刺抽吸术(PESA)获得精子，成功率为100%；NOA则多通过睾丸活检，如睾丸切开活检取精术(TESE)或显微镜下睾丸切开取精术(micro-TESE)获得精子，成功率大约为50%[2]。一项关于外科取精手术的meta分析研究提出应选择侵入性最小的取精方法[3]。根据无精子症的病因和患者情况的不同，用睾丸精子进行ICSI，成功率有很大差异[4]。NOA的受精率和临床妊娠率一般低于OA。针对NOA，辅助生殖技术(ART)实验室面临的挑战是：如何有效地处理组织且选择那些最有潜力使卵母细胞受精并发育成可用胚胎的精子。本文总结分析了目前外科常用的几种选取活的不动精子的技术及未来发展方向。

一、选择精子的常规方法

外科取精术中，切除的睾丸组织通常含有大量血红细胞，会影响精子的观察，尤其是不动精子的观察。附睾穿刺取精可获得大量精子，但也有少量的红细胞和非生殖细胞的污染，故均应对精子进行洗涤，离心去除杂质及有害物质，将沉淀制成精子悬浮液，用于精子选择。从睾丸标本中提取精子的常规方法仍然以机械划碎法为主，虽然酶处理法有效但并未广泛应用。目前，对C级精子实施选择的几种方法已经通过测试并应用到临床实践中。

1.机械接触技术(MTT)：自ICSI问世以来，只有当不动精子可用于行ICSI时，才使用MTT法区分精子是否存活。该技术是用注射针接触精子尾部，观察不动精子尾部是否柔软。若尾巴柔软并可恢复至其原形态，则该精子为活精子；若尾巴僵硬且不能恢复至原形态，则认为该精子是死精。无论是新鲜精子还是冷冻精子的TESA-ICSI周期，应用MTT技术能有效地鉴别出睾丸中活的不动精子，且睾丸中活动精子与不动精子在受精率、妊娠率和出生率方面无显著性差异[5]。MTT的优点是不使用化学物质且不改变精子的完整性，从而使得精子可随时行ICSI。但该技术的缺点是准确度低，故需要胚胎学家具有一定的经验。并且当精子数量极少时，检测非常耗时。

2.低渗肿胀试验(HOST)：低渗肿胀试验最初应用于评估精子膜的功能完整性，之后发展为鉴别用于ICSI的不活动精子的死活。原理是在低渗条件下，由于水的渗入，具有正常细胞膜功能的活精子尾部会肿胀或卷曲。经过对3种不同的低渗溶液进行比较，改良出一种更简便的低渗试验，将改进的HOST用于选择睾丸中活的不动精子并行ICSI，与非低渗对照组相比，HOST组的受精率(28.2% vs. 43.6%)和累计妊娠率(2.9% vs. 20.5%)均有所提高[6]。世界卫生组织认定HOST可替代精子染色活力试验，但是假阳性和假阴性结果则降低了此试验的准确性。张哲欢等[7]报道了1例使用HOST-ICSI技术帮助Kartagener综合征伴男性不育的患者获得正常男性后代的病例。

3.化学活性增强剂：一些ART中心会在取卵前1日进行外科取精手术，将取出的精子进行培养，使精子成熟从而获得运动能力。在OA患者中，体外培养可改善精子运动能力[8]，但培养时间超过48 h似乎会导致精子老化，这是由于DNA碎片增多和染色体结构异常增多引起的[9]。Balaban等[10]在143例NOA患者的睾丸精子培养液中添加了重组促卵泡素，发现精子的运动能力得到了改善。

随着化学增强剂的添加使用，精子培养的成效已有初步体现。例如己酮可可碱(PTF)，其可抑制磷酸二酯酶活性，从而提高细胞内环腺苷一磷酸(cAMP)的水平，而cAMP可以促进精子运动。Tademir等[11]第一个提出PTF对睾丸不动精子的运动能力具有改善作用。在附睾或睾丸精子悬浮液中添加PTF可以使活的不动精子发生运动，行ICSI后，配偶成功妊娠并得到健康婴儿[12]。解冻的睾丸精子经PTF处理后，运动能力明显提高[13]。Mangoli等[14]的一项研究指出，使用PTF选择睾丸中活的不动精子比HOST的成功率更高，而且显著缩短了鉴定和选择精子的时间。陈智勤等[15]报道在睾丸不动精子样品中加入PTF，可使不运动的活精子获得接近或达到睾丸活动精子的平均运动能力，但其安全性还需进一步验证。另有研究表明，黄嘌呤家族的另一成员——茶碱，可直接提高精子活力但时效较短[16]。茶碱在10 min内开始激活精子，最长可持续1 h，获得运动能力的精子在注射前需放入精子缓冲液中清洗，去除化学试剂。将PTF或茶碱治疗用于临床，目前虽未见子代异常的报道，但仍需更多的随访研究以证明其安全性。

4.激光辅助不动精子选择(LAISS)：Aktan等[17]利用激光鉴定活的但不能运动的精子，方法是将129 μJ的点激光打在精子尾部尖端约1.2 ms，活的但不能游动的精子尾部会发生蜷曲。若未观察到精子卷尾，则表明该精子为死精。Nordhoff等[18]证实了使用激光辅助选择睾丸不动精子后，受精率增加。陈焕华团队多次报道了应用激光从新鲜或复苏后完全不动精子中筛选存活精子行ICSI后成功妊娠[19-21]。激光的优点是不需要任何化合物诱导精子运动，但其热能量是否对精子染色体造成伤害有待研究随访，且未见大样本量的随访报道。

5.双折射偏振显微镜(BPM)技术：这项技术最早由Baccetti等[22]提出，其原理是活精子的头部结构使其可自然双折射，而死精子因结构不同不能发生双折射。应用偏振光显微镜可以观察到精子头部的双折射，判断精子的活力。在男性因素导致的不育症患者中，选择双折射阳性的不动精子进行ICSI治疗，临床妊娠率(58% vs. 9%)和着床率(42% vs. 12%)均高于阴性对照组[23]。但是这些结论尚缺乏大样本量研究，且BPM成像设备成本较高。

综上，这几种技术均可选择活的不动精子，但每种技术都有其利弊。目前也没有大样本量的研究来评估这些技术的有效性。无论使用何种技术，用不动精子进行ICSI的成功率仍低于活动精子[24]。

二、发展动态

外科取精技术应用于ICSI已有20余年，OA患者可能受益于PESA、睾丸细针抽吸术(TFNA)或TESE，但通过传统外科方式或使用手术显微镜进行多次开放切除取样是治疗NOA患者的最佳方式。胚胎学家面临的挑战是如何优化处理来自NOA患者的组织，找到更多的精子，并选择活力和形态最好的精子进行注射。目前没有文献报道实验室阶段获精率的影响因素，但这一阶段可能比外科医生的技术更为重要。现已有多种可成功选择活的不动精子的方法，ART实验室则会根据各自团队的专业知识、经验水平和设备成本等选择最合适的取精方法。有纵向随访显示，超过三分之二的NOA男性并没有实现成为生父的愿望[25]。

1.临床应用方向：人们可能会提出这样一个问题，先进的技术能否在手术过程中更准确地确定患者精子发生的进程？胚胎学家运用自动化非侵入性精子检测技术筛选精子，可在提高精子获精率的同时减少寻找时间。尽管NOA患者的治疗取得了进展，但受精率、可用胚胎率、着床率和分娩率仍远低于射精患者；与有正常精子发生的OA患者相比，NOA男性睾丸精子具有DNA碎片较高、非整倍体率增高、精子发生缺陷等特点，目前这些特点在ICSI镜下选择精子注射过程中还无法识别[26]。拉曼显微光谱学已用于人类活精子受损DNA的原位可视化研究中，但这项技术仍需进一步验证[27]。

2.实验室研究方向：对于没有成功收集到精子的NOA患者而言，目前还没有有效的治疗方案，但是对动物模型的研究可能会给恢复男性生育能力带来曙光，特别是诊断为精子成熟阻滞的患者，生殖细胞体外分化可能为其提供了一种新的治疗方法。现在，有的团队在研究小鼠的精子发生过程，有的团队在培养小鼠睾丸组织，有的团队在培养处理后的小鼠睾丸生殖细胞或精原干细胞[28]。目前正在建立各种模拟睾丸微环境的三维培养系统，例如人工支架，它模拟了曲精小管的空间环境，是研究体外精子发生的新方向[29-30]。虽然小鼠睾丸生殖细胞体外减数分裂已完成，并且完成精子体外发生后已成功受精，但将其应用到人类仍是一个具有挑战性的课题，到目前为止，培养条件似乎并不适合人类精原干细胞的增殖[31]。

将胚胎干细胞或诱导多能干细胞在体外诱导生成精子是几十年来的研究热点。在小鼠中，已将胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导成具有全能精子生成能力的原始生殖细胞样细胞，并成功生育后代，且正常发育至成年[32]。Vij等[33]综述了NOA患者恢复男性生殖能力的3种实验技术：精原干细胞移植、利用胚胎干细胞分化出成熟配子和基因治疗。但目前这些技术还不能应用于人类，除了许多尚未解决的生物学问题外，安全问题和伦理问题亦不容忽视。

三、展望

通过外科手术取出精子进行ICSI已经在无精子症患者的生育治疗方面开辟了新领域，但NOA患者的精子获精率和分娩率仍低于OA患者。从手术所获组织中筛选精子的方法和选择单个精子用于ICSI的方法取决于胚胎学家的习惯和实验室设备。虽然有几种技术已经可以最大限度地筛选出睾丸不动精子中可用的活精子，但也只有很少的NOA男性有机会获得亲生后代。改善NOA患者治疗结局的研究仍在继续。目前的研究主要集中在睾丸生殖细胞或精原干细胞体外减数分裂，以及体外诱导多能干细胞或体细胞形成精子。然而，许多生物学方面的问题仍未解决，在临床应用前仍需要仔细研究安全性和伦理问题。