Ropalladins类似物对宫颈癌Caski细胞增殖、凋亡的影响

徐欢欢，柯丽娜，黄慧敏，曾小华，朱秀莲，陈琴华，李斌

1锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地，湖北十堰442008；2湖北医药学院附属东风医院；3武当特色中药研究湖北省重点实验室(湖北医药学院)

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，化学治疗是其治疗方法中的重要一种，但化疗耐药性是宫颈癌临床治疗的一大难点，因此研发新的抗肿瘤药物是目前亟待解决的问题[1～3]。海洋生物碱提取于海洋有机生物，结构新颖，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等多种生物活性，具有良好的药用前景。以海洋生物碱作为先导化合物，对其进行结构修饰和改造，进而开发出新的抗肿瘤药物是目前新药研究的热点[4,5]。Rhopaladins A-D是从冲绳海洋被膜植物Rhopalaea sp中分离出的四种新的双吲哚生物碱，研究表明Rhopaladins A-D对与宫颈癌预后相关的癌基因C-erbB-2有显著的抑制作用[6～9]。本课题组前期合成了[10]Rhopaladins类似物E-N-叔丁基-2-对氯苯甲酰基-1-异丙基-4-对氯苄叉基-5吡咯烷酮-2酰胺这一新化合物(简称为化合物a)，那么结构类似是否功能也相似呢?2019年8～11月，本研究选用人宫颈癌Caski细胞系作为宫颈癌的体外实验模型，探讨化合物a对宫颈癌Caski细胞的增殖凋亡作用及其可能机制，为后期的抗肿瘤新药研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人宫颈癌Caski细胞购自中国典型培养物保藏中心。DMSO(MP Biomedicals公司)、RPMI 1640 细胞培养基(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、MTT粉剂(Sigma公司)、TRIzol试剂(Invitrogen公司)、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(联科生物技术有限公司)、逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)、PCR引物(上海生工生物有限公司合成)、SYBR Green real-time PCR Master Mix(TOYOBO公司)。倒置相差显微镜(Olympus 公司)、全波长酶标仪(Bio-Tek公司)、BD-FACS Calibur流式细胞仪、GeneTouchPlus基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)、荧光定量PCR仪(德国耶拿ANALYTIKJENAQTOWER 3G)。

1.2 细胞培养 Caski细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3日传代1次，取对数生长期的细胞用于实验研究。

1.3 细胞生长抑制率测定 采用MTT法。选取对数生长期的细胞，以6 000个/孔的密度接种于96孔板中，培养24 h后加药，设A～H组，A组为不含细胞仅含培养液的空白组，B组为不含药物的DMSO对照组，C～H组分别为含3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L化合物a的实验组(DMSO在各组中的含量均<0.1%)，体外培养24、48、72 h后分别加入MTT液20 μL(5 mg/mL)，在细胞培养箱中孵育4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上37 ℃低速振荡15 min，用全波长酶标仪在490 nm处读取吸光度值(OD)，并计算细胞生长抑制率=1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)。实验重复3次。根据前期实验结果，化合物a作用Caski细胞24、48、72 h的IC50分别为39.12、29.21、28.27 μmol/L，故选取后续实验药物浓度分别为12.5、25、50 μmol/L(即E、F、G组)，药物作用时间选择48 h。

1.4 细胞凋亡率测定 采用Annexin V-FITC/PI双染色法。选取对数生长期的Caski细胞接种于6孔板中培养，细胞完全贴壁后设置B组和E、F、G组，分别给予DMSO及终浓度为12.5、25、50 μmol/L的化合物a，培养48 h后收集各组细胞，按试剂盒说明操作，1 h内上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.5 E6、E7 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。分别收集DMSO对照组和E、F、G组作用48 h后的Caski细胞，TRIzol法提取细胞中的总RNA后测定RNA浓度，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。采用real-time PCR法检测不同浓度的化合物a作用于Caski细胞48 h后对E6、E7 mRNA表达的影响。在qTower 3G PCR仪上进行PCR反应，Caski E6 mRNA引物序列：上游5′-TTGCTTTTCGGGATTTATGC-3′，下游5′-CAGGACACAGTGGCTTTTGA-3′，产物长度为204 bp。Caski E7 mRNA引物序列：上游5′-GAACCGGACAGAGCCCATTA-3′，下游5′-AGAACAGATGGGGCACACAAT-3′，产物长度为150 bp。内参GAPDH mRNA引物序列：上游5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′，下游5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，产物长度为251 bp。引物均委托上海生工公司合成。PCR反应体系：SYBR Green real-time PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，加水至20 μL。Caski E6mRNA的PCR扩增程序为：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环；Caski E7 mRNA的PCR扩增程序为：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环；每个样本设3个复孔，实验重复3次。采用2-ΔΔCt计算基因的相对表达量[11]。

2 结果

2.1 不同浓度、不同时间化合物a干预后Caski细胞的生长抑制率变化 作用24、48、72 h后，与B组相比，C～H组生长抑制率均增高(P均<0.05)。见图1。

图1 不同浓度、不同时间化合物a干预后Caski细胞的生长抑制率变化

2.2 各组细胞凋亡率比较 B、E、F、G组细胞凋亡率分别为8.74%±0.77%、12.38%±0.72%、24.98%±1.34%和39.83%±1.66%，E、F、G组细胞凋亡率均高于B组(P均<0.05)。见图2。

图2 各组流式细胞术结果

2.3 各组E6、E7 mRNA表达比较 B、E、F、G组E6 mRNA表达量分别为1.010±0.207、0.667±0.081、0.575±0.123、0.345±0.060，E7 mRNA表达量分别为1.020±0.255、0.495±0.133、0.479±0.172、0.423±0.109，E、F、G组E6、E7 mRNA表达均低于B组(P均<0.05)。见图3。

注：与B组比较，*P<0.05；**P<0.01。

图3 各组E6、E7 mRNA表达比较

3 讨论

宫颈癌的发病率和病死率在全球均占第四位，2018年全球有57万例新增宫颈癌病例，31.1万死亡病例，在全球女性癌症发病和死亡病例中分别占6.6%和7.5%[12]。研究表明，宫颈癌的发生与高危型(HR)HPV感染密切相关[13]。HR HPV共有15种，其中HPV16型是最常见的HR HPV之一，故本课题选择HPV16阳性细胞Caski作为研究对象。HPV是一种嗜上皮的双链环状DNA病毒，其编码的E6、E7基因被认为是致癌基因[14]。机体感染HPV后，E6/E7基因整合到宿主染色体后表达致癌蛋白E6/E7，其与p53和pRb蛋白结合，导致细胞增殖失控，最终引发癌症[15]。E6/E7基因还可靶向调控其他癌症相关途径蛋白，最终促进细胞分裂增殖[16]。研究表明，E6基因还可结合死亡受体，从而阻断细胞凋亡[15]。此外，E6/E7基因还可上调某些致癌性miRNA水平、降低抑癌性miRNA水平[17]，抑制干扰素的信号传导途径，使病毒逃避免疫系统[16]。以上研究表明E6/E7基因是宫颈癌治疗的重要分子靶点。

海洋生物碱具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种生物活性，是新药研发的重要来源，但海洋生物碱采集困难，且提取产率较低，严重阻碍了其开发及研究。通过化学合成法对海洋生物碱类化合物进行结构修饰和改造,成为解决这一问题的有效手段[18]。本研究合成了海洋生物碱Rhopaladins类似物——化合物a，并考察其对宫颈癌Caski细胞的作用及可能机制。本研究发现，与B组相比，E、F、G组生长抑制率、细胞凋亡率均增高，表明化合物a对宫颈癌Caski细胞体外增殖具有显著的抑制作用，可诱导并促进Caski细胞的凋亡；E、F、G组E6、E7 mRNA表达均低于B组，提示化合物a抑制Caski细胞增殖并促进其凋亡的机制可能与降低E6、E7 mRNA的表达有关。

综上所述，化合物a具有抑制Caski细胞增殖并促进其凋亡的作用，其机制可能与下调E6、E7 mRNA的表达有关，但其具体机制有待进一步深入研究。