龙井茶多酚提取物对小鼠肝Cyp450酶表达的影响

吕乐，任红，孙海燕

1深圳职业技术学院 博士后创新基地，广东深圳518055；2深圳职业技术学院 深圳市发酵精制检测系统重点实验室

茶叶有很好的抗氧化、抗肿瘤、改善心血管疾病等保健功能[1]。茶多酚是其主要活性成分，含量占茶叶干重的15%～30%，主要由儿茶素、黄酮类、酚酸类和花色素四大类物质组成[2]。茶叶按照发酵程度和制法分为全发酵茶(如滇红红茶)、半发酵茶(如铁观音乌龙茶)和非发酵茶(如绿茶)[3]。Cyp450s广泛存在于动植物和微生物组织中，参与内、外源性物质代谢。临床90%以上药物的代谢都有Cyp3A4、Cyp1A2、Cyp2C9和Cyp2D6这四个亚型的参与[4]。小鼠和人的药物代谢酶基因具有同源性，即小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22相当于人Cyp3A4、Cyp1A2、Cyp2C9和Cyp2D6[5]。Cyp450s个体差异和变异性大，易受外源物质影响[6]。我们前期研究显示，铁观音茶多酚提取物能够显著改变小鼠肝Cyp450s的活性和表达[7]。2015年9月～2017年5月，我们以C57BL/6小鼠为研究对象，从基因和蛋白水平上，观察不同剂量和不同给药时长龙井茶多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37和Cyp2d22的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与动物 二级龙井茶叶，购于杭州西湖，烘干，粉碎，过80目筛，常温避光在干燥罐保存。SPF级雌性C57BL/6小鼠80只，7～8周龄，体质量(18±2)g，购于南方医科大学实验动物中心[许可证号SCXK(粤)2016-0041]，饲养条件为相对湿度50%～60%、温度20～25 ℃，光照/黑暗各12 h。

1.1.2 试剂与仪器 Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22多克隆兔抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(Abcam公司)；PCR仪(德国Eppendorf公司)；LightCycler 1.5荧光定量PCR仪(Roche公司)；电泳系统、转膜系统、全自动凝胶成像仪[Bio-Rad生命医学产品(上海)有限公司]；Spectra Max M5e多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

1.2 龙井茶多酚的提取方法及成分检测

1.2.1 龙井茶多酚提取方法 龙井茶多酚提取物的提取参照国家标准(GBT8313-2018)并根据实验室条件稍作调整：取20 g过筛的龙井茶粉末，按1∶25(w/v)的比例加入70 ℃预热的70%甲醇，70 ℃水浴浸提30 min。浸提后，将体系冷却至室温，布氏漏斗抽滤，滤渣继续重复浸提2次。合并3次的滤液，旋转蒸发浓缩至滤液原体积的15%～20%，确保甲醇几乎被除尽，浓缩液采用氯仿3∶1(v/v)萃取一次，分层后弃去氯仿层，采用旋转蒸发将水萃取层浓缩至原体积的5%，再用适量超纯水复溶。10 000 r/min，低温离心15 min，上清液冷冻干燥后，常温避光干燥保存。采用Folin-Ciocalteu法[8]测定龙井茶多酚提取物中总多酚的含量为(123.68±3.39)没食子酸当量(mg GAE/g DW)。

1.2.2 龙井茶多酚成分检测[9]采用HPLC法检测龙井茶多酚提取物中的主要酚类物质，其中含量较高的成分为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)288.83 μg/mg(占28.88%)、表没食子儿茶素(EGC)57.74 μg/mg(占5.77%)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)42.08 μg/mg(占4.21%)、表儿茶素(EC)21.14 μg/mg(占2.11%)等。

1.3 龙井茶多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37和Cyp2d22的影响观察

1.3.1 以龙井茶多酚提取物不同剂量为分组的设计 取40只小鼠，随机分为空白组、75 mg/kg组、150 mg/kg组、300 mg/kg组，每组10只。龙井茶多酚提取物组给予75、150、300 mg/(kg·d)灌胃，空白对照组给予超纯水0.1 mL/(10 g·BW)灌胃，各组连续灌胃7 d。

1.3.2 以龙井茶多酚提取物不同给药时长为分组的设计 取另外40只小鼠，随机分为对照组、7 d组、14 d组、28 d组，每组10只。7 d组、14 d组、28 d组以龙井茶多酚提取物150 mg/(kg·d)分别灌胃7、14、28 d，对照组给予超纯水0.1 mL/(10 g·BW)灌胃28 d，在灌胃2 h之后正常进食、饮水。

1.4 肝脏Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22 mRNA表达检测 采用real-time PCR法。在末次灌胃2 h后处死各组小鼠，迅速分离肝脏，用预冷的生理盐水洗净血迹，滤纸拭干水迹，-80 ℃冻存备用。称取-80 ℃冻存的小鼠肝脏组织约50 mg，按Takara UNIQ-10柱式TRIzol法提取总RNA，并测定总RNA浓度。按PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒操作，将RNA逆转录成cDNA。之后采用SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)试剂盒进行相对定量。肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，所有操作在冰上进行。采用比较阈值法(2-ΔΔCt)法定量。引物序列[10～12]见表1。

表1 Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22引物序列

1.5 肝脏Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22蛋白表达检测 采用Western blotting法。称取-80 ℃冻存的小鼠肝脏组织约80 mg，加入预冷的NP40裂解液1 mL，于冰上操作，FastPrep-24匀浆，4 ℃，12 000 r/min，30 min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度，将样品蛋白浓度调整至5 mg/mL，按4∶1加入5×loading buffer，100 ℃加热5 min，冰上冷却，离心，混匀，分装，-80 ℃放置备用。取出-80 ℃冻存的制备好的蛋白样品，100 ℃再次加热5 min。冰上冷却混匀。制胶、上样5 μL、电泳、转膜、封闭、一抗(GADPH、Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22)孵育、二抗孵育、显影成像。显影后将所得的蛋白质条带用Image Lab 5.1软件分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。方差同质性检验数据的方差齐性，方差齐时进行单因素方差分析。单因素方差分析后采用LSD进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量龙井茶多酚提取物对Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22的影响

2.1.1 对Cyp3a11 mRNA及蛋白表达的影响 与空白组相比，300 mg/kg组Cyp3a11 mRNA表达降低，75 mg/kg组、150 mg/kg组Cyp3a11蛋白表达均降低(P均<0.05)。见图1。

注：A为Cyp3a11的mRNA相对表达水平,B为Cyp3a11的蛋白相对表达水平;与空白组比较，*P<0.05。

2.1.2 对Cyp1a2 mRNA及蛋白表达的影响 与空白组相比，150 mg/kg组Cyp1a2 mRNA及蛋白表达均增高(P<0.05)。见图2。

2.1.3 对Cyp2c37 mRNA及蛋白表达的影响 与空白组相比，150 mg/kg组、300 mg/kg组Cyp2c37 mRNA及蛋白表达均降低(P均<0.05)。见图3。

注：A为Cyp1a2的mRNA相对表达水平,B为Cyp1a2的蛋白相对表达水平;与空白组比较，*P<0.05。

图2 不同剂量龙井茶多酚提取物对Cyp1a2 mRNA及蛋白表达的影响

2.1.4 对Cyp2d22 mRNA及蛋白表达的影响 与空白组相比，300 mg/kg组Cyp2d22 mRNA表达降低，150 mg/kg组、300 mg/kg组Cyp2d22蛋白表达均降低(P均<0.05)。见图4。

2.2 龙井茶多酚提取物不同给药时长对Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22的影响

2.2.1 对Cyp3a11 mRNA及蛋白表达的影响 Cyp3a11 与对照组相比，7 d组Cyp3a11 mRNA及蛋白表达均降低，28 d组Cyp3a11 mRNA及蛋白表达均增高(P均<0.05)。见图5。

注：A为Cyp2c37的mRNA相对表达水平,B为Cyp2c37的蛋白相对表达水平;与空白组比较，*P<0.05。

图3 不同剂量龙井茶多酚提取物对Cyp2c37 mRNA及蛋白表达的影响

注：A为Cyp2d22的mRNA相对表达水平,B为Cyp2d22的蛋白相对表达水平;与空白组比较，*P<0.05。

图4 不同剂量龙井茶多酚提取物对Cyp2d22 mRNA及蛋白表达的影响

2.2.2 对Cyp1a2 mRNA及蛋白表达的影响 Cyp1a2 与对照组相比，7 d组Cyp1a2 mRNA及蛋白表达均增高，28 d组Cyp1a2 蛋白表达增高(P均<0.05)。见图6。

注：A为Cyp3a11的mRNA相对表达水平,B为Cyp3a11的蛋白相对表达水平;与空白组比较，*P<0.05。

图5 龙井茶多酚提取物不同给药时长对Cyp3a11 mRNA及蛋白表达的影响

注：A为Cyp1a2的mRNA相对表达水平,B为Cyp1a2的蛋白相对表达水平;与空白组比较，*P<0.05。

图6 龙井茶多酚提取物不同给药时长对Cyp1a2 mRNA及蛋白表达的影响

2.2.3 对Cyp2c37 mRNA及蛋白表达的影响 Cyp2c37 与对照组相比，7 d组Cyp2c37 mRNA及蛋白表达均降低(P均<0.05)。见图7。

2.2.4 对Cyp2d22 mRNA及蛋白表达的影响 Cyp2d22 与对照组相比，7 d组Cyp2d22 mRNA及蛋白表达均降低，14 d组Cyp2d22 蛋白表达增高，28 d组Cyp2d22 mRNA及蛋白表达均增高(P均<0.05)。见图8。

注：A为Cyp2c37的mRNA相对表达水平,B为Cyp2c37的蛋白相对表达水平;与空白组比较*，P<0.05。

图7 龙井茶多酚提取物不同给药时长对Cyp2c37 mRNA及蛋白表达的影响

注：A为Cyp2d22的mRNA相对表达水平,B为Cyp2d22的蛋白相对表达水平;与空白组比较，*P<0.05。

图8 龙井茶多酚提取物不同给药时长对Cyp2d22 mRNA及蛋白表达的影响

3 讨论

茶叶是风靡全世界的饮品，尤其受到东方人的喜爱。我国历来就有“药茶不能同食”的说法，但始终缺乏全面严谨的理论和实验依据。肝脏是药物代谢的主要场所，肝药酶是肝脏中药物生物转化或代谢的主要酶系。国内外研究均显示，Cyp450s变异性较大，易受外源物质的诱导或抑制，从而使自身活性发生改变，导致药物代谢速度改变，引起药效减弱以致治疗失败或药效过强引起毒性[13]。因此，探明茶多酚对Cyp450s的诱导或抑制作用，阐明药茶不能同食的原理，从而尽可能减少茶叶对药物代谢的影响，保证临床药物浓度维持在安全有效的范围内有着重要的意义。

杭州西湖龙井是一种著名的绿茶，已有研究表明，与其他不同发酵程度茶叶相比，西湖龙井的绿茶多酚含量较高，其成分以儿茶素为主，主要含有EGCG、EGC、ECG、EC四种，其中尤以EGCG含量最高[1]。目前国内外对绿茶多酚的研究主要集中在其抗氧化及抗肿瘤作用上，但对其影响肝药酶进而干扰同服底物药物的代谢作用研究较少。本实验通过给予小鼠不同剂量和不同服用时间的龙井茶多酚提取物，分别从基因转录水平和蛋白表达水平上对龙井茶多酚提取物对小鼠肝Cyp450s四种主要亚型Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2d22和Cyp2c37的作用进行了探讨。

本研究结果表明，龙井茶多酚提取物中的主要酚类物质含量最高的是EGCG，占28.8%，其次含量较高的分别有EGC、ECG和C等物质。本研究发现，与空白组相比，150 mg/kg组和300 mg/kg组Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 mRNA及蛋白表达均降低，但150 mg/kg组Cyp1a2 mRNA及蛋白表达均增高，表明150 mg/kg和300 mg/kg龙井茶多酚提取物均能够显著抑制小鼠肝Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 mRNA及蛋白表达，上调Cyp1a2的mRNA及蛋白表达，150 mg/kg组龙井茶多酚提取物能显著性提高Cyp1a2的蛋白表达水平；在时效关系的研究中，随着给予茶多酚提取物的时间由7 d逐渐延长到28 d，龙井茶多酚提取物对Cyp3a11和Cyp2d22的作用由抑制转为诱导，对Cyp2c37的抑制作用逐渐消失，但并未表现出诱导作用，而随着给药时间的延长龙井茶多酚提取物对Cyp1a2的诱导作用未发生改变。实验结果提示，龙井茶多酚提取物的摄入量和时间均能影响小鼠肝Cyp450s酶的表达，75 mg/kg龙井茶多酚提取物对该酶四种亚型几乎无影响，150 mg/kg和300 mg/kg龙井茶多酚提取物对小鼠肝Cyp450s酶呈现显著诱导或抑制作用，且随着给药时间的延长，这种诱导或抑制作用也会发生改变，继而会加快或减慢与茶叶同服药物的体内代谢过程，从而使血药浓度产生波动，不利于药效的发挥。该实验结果也为“药茶不能同食”的传统说法提供了较为全面的实验依据。

有研究报道称低剂量EGCG能够抑制Cyp3A4的活性，但也有研究报道称短期的高剂量EGCG对Cyp3A4有显著的诱导作用[14,15]，但对于茶多酚提取物影响肝药酶的作用少见系统研究。本课题组前期曾对黄山毛峰茶多酚提取物对肝药酶的作用进行了研究，结果表明，连续给予7 d 75、150和300 mg/(kg·d)黄山毛峰茶多酚提取物，均能显著诱导小鼠Cyp3a11 mRNA和蛋白表达[16]。本研究结果则提示，与黄山毛峰茶多酚提取物对小鼠Cyp3a11的诱导作用不同，龙井茶多酚在连续给予7 d时能够抑制Cyp3a11的表达，但随着给予时间延长到28 d，龙井茶多酚和黄山毛峰一样，显示出对Cyp3a11的诱导作用，表明茶叶的种类、饮用量、引用时间等均会对肝药酶产生不同的影响。茶多酚提取物中含多种茶多酚单体成分，这些成分对Cyp450s酶的影响是互相叠加还是互相拮抗，究竟哪一种单体成分起到关键的作用，这些问题都有待进一步的深入研究。