羟基喜树碱对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响及机制

孙亦鹏，倪振华，张孟哲，毕俊杰，林玉华，王雄彪

上海中医药大学附属普陀医院，上海200062

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症死亡的主要原因，并带来巨大的社会和经济负担。传统的化疗药不良反应大、容易产生耐药；靶向药物尽管取得了一定的疗效，但存在耐药、易复发等问题[1]。羟基喜树碱(HCTP)是由珙桐科植物喜树的果实、叶提取的喜树碱进一步合成而得，对肺癌、宫颈癌、神经母细胞癌等都具有抗癌作用[2～4]，与化疗药物或靶向药联用可增加疗效，但其具体作用机制有待深入研究。研究表明，凋亡的失调是导致肺癌的发生、浸润和转移的机制之一[5]。而wnt/β-catenin通路在调节凋亡的过程中起到重要作用，抗癌药β-Asaron诱导癌细胞凋亡的机制就是抑制了β-catenin蛋白的表达，用β-catenin的激活剂可逆转该药的致凋亡作用[6]。2018年10月～2019年9月，我们用不同浓度的HCPT处理A549肺癌细胞，观察HCPT对A549细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 A549人肺癌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库，培养于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。HCPT(selleck公司)；RPMI-1640培养基(Thermo公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；CCK-8、Annexin V和PI(Dojindo公司)；二甲基亚砜(Amresco公司)；Caspase-8活性检测试剂盒(Promega公司)；蛋白裂解液(碧云天公司)；Bcl-2(#2876)、Bcl-xl(#2764)、β-catenin(#9582)、羊抗兔二抗(#7074)、羊抗鼠二抗(#7076)购自CST公司；β-actin(ab6276，Abcam公司)；Powerpac基础型电泳仪、转膜仪、化学发光成像仪(Bio-Rad公司)。

1.2 HCPT溶液配制 按照说明书，将HCPT配制成不同终浓度(5、10 mmol/L)的溶液，DMSO终浓度<0.1%。

1.3 细胞分组 用0、5、10 μmol/L的 HCPT处理细胞，将细胞分为对照组、HCPT-5组和HCPT-10组。

1.4 细胞增殖情况检测 采用CCK-8实验。将各组细胞以1×104/孔接种于96孔培养板，每组重复12孔。在细胞对数生长期，对照组、HCPT-5组和HCPT-10组分别加入0、5、10 μmol/L的HCPT干预24 h或48 h，弃培养基，加入CCK-8，继续孵育3 h。在酶联免疫检测仪上选择波长450 nm处，测定各实验孔OD值。细胞生存率=HCPT处理组OD值/对照组OD值×100%。

1.5 细胞凋亡情况检测 采用流式细胞术。取对数生长期A549细胞，以3×105/mL接种于6孔培养皿，培养密度达60%～70%。对照组、HCPT-5组和HCPT-10组分别加入0、5、10 μmol/L的HCPT干预48 h，收集细胞，PBS漂洗，采用Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒检测凋亡细胞比例。每组重复3次。各组细胞凋亡率为Annexin V(+)、PI(+)与Annexin V(+)、PI(-)之和。

1.6 Caspase-8活性检测 采用生物荧光法。收集A549细胞，以1×104/孔细胞接种于96孔板。细胞培养过夜后，对照组、HCPT-5组和HCPT-10组分别加入0、5、10 μmol/L 的HCPT干预48 h后，每孔加入100 μL Caspase-8底物，混合孵育3 h后，采用Promega GloMax 20/20发光检测仪检测各孔吸光值。

1.7 Bcl-2、Bcl-xl和β-catenin蛋白表达检测 采用Western blotting法。将各组细胞以密度为5×105接种在6孔板中培养。对照组、HCPT-5组和HCPT-10组分别加入0、5、10 μmol/L的HCPT干预24 h或48 h。用PBS漂洗后，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液进行裂解15 min，12 000 r/min离心，收集上清液。用BCA法对蛋白样品定量后，加入蛋白上样缓冲液，金属浴100 ℃加热10 min充分变性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白组分，将蛋白转印于PVDF膜上，5%BSA室温封闭2 h，分别加入Bcl-2、Bcl-xl、β-catenin和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜，次日TBST溶液漂洗10 min×3次，加入HRP标记的二抗，TBST溶液漂洗10 min×3次，ECL显色后胶片曝光。最终结果用Image J分析相对表达量。以目的蛋白与β-actin灰度比值表示各目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖情况比较 与对照组相比，HCPT-5和HCPT-10组的细胞生存率降低，且HCPT-10组细胞生存率低于HCPT-5组(P均<0.01)。见表1。

表1 各组细胞增殖情况比较

注：与对照组相比，aP<0.01；与HCPT-5组相比，bP<0.01。

2.2 各组细胞凋亡率比较 对照组、HCPT-5组、HCPT-10组细胞凋亡率分别为1.73%±0.32%、27.99%±4.38%、38.1%±4.45%，与对照组相比，HCPT-5组和HCPT-10组细胞凋亡率均增高(P均<0.01)，并且HCPT-10组细胞凋亡率高于HCPT-5组(P<0.01)，见图1。

图1 HCPT对A549细胞凋亡的影响(流式细胞术)

2.3 各组细胞凋亡相关蛋白表达比较 与对照组相比，在药物处理48 h后，HCPT-5、HCPT-10组的Bcl-2蛋白表达均下降(P均<0.01)；HCPT-5、HCPT-10组的Bcl-xl蛋白表达均下降(P均<0.01)；HCPT-5和HCPT-10组的Caspase-8活性均增高(P均<0.01)，见图2、表2。

图2 各组细胞凋亡相关蛋白表达情况(Western blotting法)

组别Bcl-2/β-actinBcl-xl/β-actinCasoase-8活性(×104)对照组1.00±0.001.00±0.0046.55±10.28HCPT-5组0.95±0.130.78±0.09a153.90±19.50HCPT-10组0.58±0.09bc0.44±0.11bc177.02±37.94

注：与对照组相比，aP<0.05，bP<0.01;与HCPT-5组相比，cP<0.01。

2.4 各组细胞β-catenin蛋白表达比较 与对照组相比，药物处理24、48 h后，HCPT-5组和HCPT-10组β-catenin蛋白表达均降低(P均<0.01)。见图3、表3。

图3 HCPT对β-catenin蛋白表达的影响

表3 各组细胞β-catenin蛋白表达比较

注：与对照组相比，aP<0.05，bP<0.01;与HCPT-5组相比，cP<0.01。

3 讨论

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，据估测，2018年新发肺癌病例为234 030例，死亡病例为158 770例[7]。由于大多数肺癌患者在发现时已是晚期或者已有转移(ⅢB或Ⅳ)，无法手术早期切除，因而目前在肺癌治疗上，化疗仍然是重要的治疗手段。然而，化疗对部分患者并不敏感，而且存在不良反应大、容易耐药等问题。靶向药物是近年肺癌治疗上的重大突破，但靶向药物不适用于小细胞肺癌的治疗，而且靶向药物也存在耐药和复发问题[8]。中草药以其独特的优势在肺癌治疗上可有效弥补现代医学的缺憾。

HCPT是从植物喜树的果实或叶中提取并进一步加工而成。喜树，《中华本草》记载其具有“清热解毒，散结消癥”之功效。名老中医张士舜[9]灵活运用喜树果治疗肺腺癌效果显著。现代药理研究表明，HCPT可干扰DNA S期复制和RNA转录，从而抑制核酶拓扑异构酶Ⅰ的活性，对多种肿瘤都具有抑制作用[10]；可诱导肺癌细胞发生自噬从而发挥肿瘤杀伤作用[2]。HCPT联合其它药物可增强抗肿瘤作用。比如HCPT联合雷公藤内酯可激活PP2A介导的信号通路增强对肺癌细胞的凋亡作用[11]；羟基喜树碱联合化疗栓塞治疗中晚期肝癌取得良好效果[12]；吉非替尼联合HCPT心包灌注可改善携带EGFR突变和恶性心包积液的晚期非小细胞肺癌患者的无进展生存期[13]。本研究发现，HCPT-5组和HCPT-10组细胞生存率均低于对照组，表明HCPT可抑制A549细胞的增殖；HCPT-5组和HCPT-10组

的凋亡率均高于对照组，并且HCPT-5组和HCPT-10组的Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达低于对照组、Caspase-8活性高于对照组，这表明HCPT可激活Caspase-8活性、抑制Bcl家族蛋白，从而在细胞外和细胞内水平诱导癌细胞的凋亡。

Wnt/β-catenin信号转导通路是一条在生物进化中极为保守的通路，其中β-catenin是Wnt信号转导通路中的一个关键下游效应分子。在正常的体细胞中，β-catenin只是作为一种细胞骨架蛋白，在胞膜处与E-cadherin形成复合体，对维持同型细胞的黏附、防止细胞的移动发挥作用[14]。当细胞内Wnt信号激活时，β-catenin在胞质中积累起来并进入细胞核与TCF/LEF转录因子家族作用，并促进特定基因的表达。已有研究证实，Wnt/β-catenin信号通路在肺癌的的发生中被异常激活，并且与肺癌患者生存密切相关[15]。在肺癌细胞中，通过药物抑制β-catenin的表达可以显著抑制肺癌细胞的增殖、诱导肺癌细胞的凋亡[6]。本研究发现，HCPT-5组和HCPT-10组的β-catenin蛋白表达低于对照组，表明HCPT诱导凋亡可能与Wnt/β-catenin通路有关。

综上所述，HCPT可抑制A549肺癌细胞的增殖、促进其凋亡，其机制可能与抑制β-catenin的表达有关。