吸入异氟烷对心肌缺血再灌注损伤大鼠的影响及机制

范晓英，薛沙，李静，张万平，郑仲磊

西安医学院第二附属医院，西安710038

心血管疾病是临床常见的疾病，缺血再灌注损伤是一种常见的临床并发症[1]，如何解决这一难题在临床上具有重要意义。异氟烷是临床常用的吸入麻醉药，可减少出现缺血再灌注损伤的可能[2～4]，有研究结果显示这与多条信号通路被激活有关，机制相当复杂，其中十分重要的一条信号通路可能是p38有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号转导通路。若可及时阻断或抑制该通路或许可以预防缺血再灌注损伤的发生，但是目前这一观点还缺乏有效的实验证据。2018年12月～2019年3月，我们通过手术结扎冠状动脉的方式制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，并给予p38 MAPK抑制物异氟烷吸入进行处理，探讨吸入异氟烷对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 健康成年SPF级SD大鼠48只，雌雄各半，体质量200～300 g。HRPO标记羊抗兔IgG(1.0 g/L)(深圳晶美生物公司)、p38MAPK和p-p38一抗(Bioworld公司)、BSA(Roche，北京索莱宝科技有限公司)、超敏ECL化学发光试剂盒(中国碧云天生物技术公司)、BCA蛋白定量试剂盒、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)等。

1.2 动物分组及心肌缺血再灌注损伤模型制备 将48只大鼠按照随机分组原则分为假手术组、异氟烷+假手术组、模型组和模型+异氟烷组，每组12只。模型组、模型+异氟烷组参考相关文献[5～7]采用冠状动脉前降支结扎，制备心肌缺血再灌注损伤模型：手术前进行全身麻醉，固定于解剖板上，剪开胸部皮肤，从第5肋间开始从下而上沿前正中线和左侧锁骨中线剪开胸壁和心包，暴露心脏，在左心耳下缘处用5406-0无损伤缝合线穿入左冠状动脉前降支，平稳30 min后结扎(以心外膜变成灰白色、心电图出现ST段呈弓背向上变化为发生心肌缺血)，缺血30 min后，解开结扎的冠状动脉左前降支，恢复血液再灌注3 h，制备心肌缺血再灌注损伤模型。假手术组、假手术+异氟烷组仅开胸穿线不结扎。

1.3 干预方法 假手术+异氟烷组和模型+异氟烷组造模后利用异氟烷挥发罐吸入浓度为1.0 MAC(1.38%)的异氟烷，吸入时间为30 min，吸入完成后需排出15 min。假手术组和模型组造模后吸入氧气代替异氟烷进行干预。

1.4 观察指标

1.4.1 心功能 吸入异氟烷后或相同时间点，利用生物机能系统监测动物的心功能指标，包括射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、左室收缩期平均压(LVSP)和左室舒张末期压力(LVEDP)。

1.4.2 心肌缺血程度及梗死程度 快速腹腔注射大剂量乌拉坦处死动物，迅速取下心脏，用生理盐水冲洗后，垂直于心脏纵轴将心脏切为5片。用TTC复染15 min后迅速投入4%中性多聚甲醛中固定，高清相机拍摄照片，导入Image pro plus 6.0软件，计算心肌梗死程度和缺血程度。正常面积为蓝色，梗死面积为白色，缺血面积为红色。缺血程度=缺血面积/正常面积×100%，梗死程度=梗死面积/缺血面积×100%。

1.4.3 心肌组织病理学改变 采用HE染色法。取梗死心肌组织行HE染色，200倍光镜下观察病理学改变。

1.4.4 心肌组织p-p38、p38含量 采用Western blotting法检测。取梗死心肌组织，加入9倍体积的预冷细胞裂解液手动匀浆，取上清液用BCA试剂盒定量，每个样本取15 μg蛋白进行分离鉴定。切取目的蛋白所在范围条带，用半干转膜仪将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，加入一抗4度孵育过夜(兔抗大鼠p-p38、兔抗大鼠p38)，除去一抗后加入羊抗兔二抗室温孵育2 h，除去二抗后用ECL法显色，Kodak胶片曝光后读取灰度值并截图分析，比较各组p-p38/p38比值。

1.4.5 心肌组织MDA、SOD含量 处死动物后迅速取下心脏，生理盐水冲洗，加入9倍体积预冷生理盐水在冰盒上手动匀浆，离心10 min，取上清液,采用MDA和SOD试剂盒检测MDA和SOD含量。

2 结果

2.1 各组心功能指标比较 与假手术组相比，模型组LVEDP升高，EF、FS、LVSP均降低(P均<0.05)；与模型组相比，模型+异氟烷组LVEDP降低，EF、FS、LVSP均升高(P均<0.05)。见表1。

表1 各组心功能指标比较

注：与假手术组比较，﹟P<0.05；与假手术+异氟烷组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.2 各组心肌缺血程度及梗死程度比较 与假手术组相比，模型组心肌缺血程度及梗死程度均增高(P均<0.05)；与模型组比较，模型+异氟烷组心肌缺血程度及梗死程度均降低(P均<0.05)。见表2。

表2 各组心肌缺血程度及梗死程度比较

注：与假手术组比较，﹟P<0.05；与假手术+异氟烷组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.3 各组心肌病理学改变 假手术组和假手术+异氟烷组未见任何异常；模型组明显可见心肌细胞坏死，心肌纤维溶解、断裂，间隙明显增宽;模型+异氟烷组心肌细胞损伤得到明显改善，偶见断裂、溶解、坏死的心肌纤维和间隙增宽，见图1。

注：a为模型+异氟烷组，b为模型组，c为假手术组，d为假手术+异氟烷组。

图1 各组心肌病理学改变(HE染色法)

2.4 各组心肌组织p-p38、p38含量比较 假手术组、假手术+异氟烷、模型组、模型+异氟烷p-p38/p38比值分别为0.19±0.06、0.20±0.09、0.71±0.06、0.50±0.09，模型组p-p38/p38比值高于假手术组(P<0.05)，模型+异氟烷组p-p38/p38比值低于模型组(P<0.05)，假手术+异氟烷组与假手术组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 各组心肌组织p-p38、p38蛋白表达情况(Western blotting法)

2.5 各组心肌组织MDA、SOD含量比较 与假手术组相比，模型组心肌组织MDA含量增高、SOD活性降低(P均<0.05)；与模型组比较，模型+异氟烷组MDA活性降低、SOD活性增高(P均<0.05)。见表3。

表3 各组心肌组织MDA、SOD含量比较

注：与假手术组比较，﹟P<0.05；与假手术+异氟烷组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3 讨论

目前有关心肌再灌注损伤的机制仍不明朗。已有研究表明，心肌再灌注损伤的发生机制受多种因素的影响，包括代谢紊乱、氧自由基大量释放、炎症反应和钙离子超载等。一旦出现缺血再灌注损伤，不仅使患者心功能大大降低，还限制了临床治疗效果，例如心脏搭桥手术、介入治疗、溶栓术等[8]。磷酸化级联反应中的p38 MAPK信号通路参与多种生物学行为的调控，由多种细胞因子和酶共同参与，若该通路被激活，将会引起心肌细胞的凋亡和坏死，活化中性粒细胞，增加细胞活素类物质和黏附分子的表达量，使胞质蛋白质和逆转录因子磷酸化，从而加剧心肌缺血再灌注损伤。因此，通过降低p38 MAPK通路的活性，可能会抑制甚至逆转心肌缺血再灌注损伤，从而恢复受损的心脏功能。

已有研究证实，异氟烷可有助于恢复患者的心脏功能，其作用机制复杂，可从多个方面发挥作用，一方面异氟烷可作用于KATP通道，从而加快冠状动脉血流速度，增加血流量，舒张冠状动脉；另一方面异氟烷可以与细胞膜上的L型钙通道结合，从而阻止钙离子内流，降低心肌细胞的氧化应激损伤，加强细胞膜的作为心肌细胞的第一道防线作用。除此之外，异氟烷还可减少心肌细胞凋亡，抑制炎性因子的生成与释放，抑制线粒体膜通透转换孔道开放，诱导热休克蛋白的表达，这些共同作用从而发挥心脏保护功能。本研究发现，与假手术组相比，模型组LVEDP升高，EF、FS、LVSP均降低，表明心肌缺血再灌注可抑制大鼠心脏功能；与模型组相比，模型+异氟烷组各项心脏功能均得到改善，表明在心肌缺血再灌注损伤过程中给予异氟烷干预可抵抗这种损伤，保护心脏功能。

对心肌细胞进行梗死程度和缺血程度分析，是评价心肌保护作用的金标准。本研究发现，与模型组比较，模型+异氟烷组心肌缺血程度和梗死程度均降低，表明心肌缺血后给予吸入异氟烷干预，可降低心肌细胞的缺血程度和梗死程度，提示给予异氟烷干预可有效抑制心肌缺血再灌注损伤，降低心肌梗死程度。

心肌缺血再灌注损伤所致的病理变化主要为心肌纤维断裂、排列紊乱、心肌纤维间隙增宽、心肌细胞溶解坏死等，可导致心力衰竭、心功能紊乱、心肌细胞功能异常[9]。本研究发现，模型组可见心肌细胞坏死，而模型+异氟烷组心肌细胞损伤得到明显改善，表明给予异氟烷干预可有效缓解心肌损伤。

MAPK是人体内存在的一种很重要的酶，参与机体多种生理过程，包括细胞增殖、基因表达等，与细胞的凋亡、存活、分化、生长等密切相关[10]。MAPK可通过炎症因子、高渗环境、热休克、缺血再灌注损伤等途径激活，p-p38和p38就是其中一条重要的信号通路。研究显示，该通路的活化可加重机体的损伤[11]。本研究发现，模型组p-p38/p38比值高于假手术组，表明缺血再灌注损伤的心肌中磷酸化的p38所占比例更高；模型+异氟烷组p-p38/p38比值低于模型组，表明心肌细胞在缺血再灌注损伤过程中给予异氟烷干预可有效抑制p38磷酸化，保护心肌免受损害。

研究显示，体内的氧化应激反应与缺血再灌注损伤有密不可分的关系。MDA和SOD是反映氧化应激反应最常用也是最敏感的指标。体内清除氧自由基很大程度上依赖于SOD，其活性高低直接影响自由基清除能力，清除体内自由基可帮助机体免于氧化损伤，也避免了缺血再灌注损伤的加重；体内在受到氧化应激损伤的同时，膜脂质过氧化反应也会增强，进一步加重损伤，这一过程的终产物就是MDA，若机体受到氧化应激损伤，则其含量会随之增高，细胞也会因此严重受损，自由基生产增加[12]。本研究发现，与模型组比较，模型+异氟烷组MDA活性降低、SOD活性增高，表明心肌缺血后给予异氟烷干预可明显增强SOD的活性、降低MDA的含量，提示给予异氟烷不仅可以增强机体清除自由基的能力，还可抑制膜脂质过氧化反应，减少自由基的产生，有效降低机体所受的氧化应激损伤，最终使缺血再灌注损伤程度降低。

综上所述，吸入异氟烷可有效恢复缺血再灌注损伤大鼠的心脏功能，改善心肌细胞的病理变化，减少心脏的梗死程度和缺血程度，其机制可能为抑制p38MAPK信号通路活化、减少氧化应激损伤。