恒牙与乳牙牙髓干细胞增殖及唾液腺分泌相关分子基因表达比较

庞真贞 李硕 刘钦赞 李晔 王良

牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有多向分化的潜能，除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型[1,2]。牙髓干细胞有以下优点，来源丰富，6～11岁自然脱落的牙齿中、成人需要拔掉的牙齿中均有丰富的牙髓干细胞[3,4]，因此无伦理争议。本文分析乳牙与恒牙牙髓中唾液腺分泌相关分子水平，分析其是否具有治疗唾液腺分泌功能低下的临床价值。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年1～12月的6～11岁脱落乳牙10颗与18～25岁因正畸拔除的完整磨牙10颗，牙齿健康，患者及家属对治疗方法知情同意，对本研究知情同意。排除标准：合并龋齿、根尖病、牙周病。试剂及仪器：20%胎牛血清，DMEM，细胞筛网。

1.2 干细胞纯化扩增

1.2.1 牙髓干细胞：取上述刮牙周膜组织牙齿，切开牙冠，暴露牙髓，取出牙髓，浸入3倍双抗PBS中，后续操作同上，待细胞汇合至80%，传代。

1.2.2 细胞纯化、扩增：分别收集培养的处于对数生长期的牙周膜细胞与牙髓细胞上清液，作为适应性培养基；对培养细胞消化、离心、去上清，加适应性培养基，吹打，过细胞筛，制成单个细胞超过悬液90%，调增细胞密度为每毫升10～15个，接种与96孔培养板，每孔100 μl，培养24 h、48 h，标记单个细胞孔，补至每孔200 μl，第6天，半量换液，随后每3天换1次。7～14 d，细胞数≥50为出现细胞克隆，待克隆细胞至孔底1/2～2/3后，用0.25%胰酶消化，离心，去上清，移至48孔培养板，继续培养，至24孔、12孔、6孔，转入6 cm、10 cm培养皿，获取去量实验用细胞。分别取第6代与第8带牙髓干细胞进行分析。

1.3 第6代与第8代牙髓干细胞生长曲线 将细胞悬液调为密度1×104/ml，接种至96孔板，分为12组，每组6个复孔，分别培养1～10 d，每天取1组，弃培养液，每孔加基础培养基，5%CO2，37℃培养4 h，酶标仪492 nm处测A值，重复3次，取平均值，比较同一时间两种细胞OD值。

1.4 第6代与第8代牙髓干细胞标志物测定 制备细胞混悬液，密度为1×106/ml，分别装入EP管中，标记，每组6个管，加入浓度为0.2 mg/ml的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146、CD166对应的同型抗体浓度。4℃避光孵育50 min，PBS重悬，离心，弃上清，加PBS重悬，过滤，流式细胞仪测定分析。

1.5 唾液腺分泌相关分子表达 提取牙髓干细胞总RNA，逆转录为cDNA，采用qPCR方法检测，检测相关分子基因序列参考文献[1]。检测相关分子包括MR1(毒蕈碱型乙酰胆碱受体1)，MR3(毒蕈碱型乙酰胆碱受体3)，APQ5(水通道蛋白5)，β1-AR(β1-肾上腺素受体)，β2-AR(β2-肾上腺素受体)，α-淀粉酶，黏蛋白5B。

2 结果

2.1 第6代与第8代牙髓干细胞增殖比较 第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙牙髓干细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)，均在第9天达到平台期。见表1。

类别1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d第6代乳牙0.23±0.080.26±0.080.50±0.100.69±0.121.02±0.231.41±0.321.55±0.411.61±0.441.73±0.481.75±0.51第8代乳牙0.24±0.080.28±0.090.53±0.110.70±0.211.05±0.321.42±0.331.60±0.461.63±0.421.75±0.501.77±0.53第6代恒牙0.23±0.090.30±0.100.55±0.160.73±0.221.04±0.331.42±0.361.62±0.511.62±0.441.78±0.551.83±0.60第8代恒牙0.25±0.080.29±0.090.56±0.170.72±0.211.06±0.351.44±0.451.61±0.501.65±0.461.72±0.561.79±0.55F值0.0810.2150.2190.0530.0180.0070.0260.0150.0150.023P值0.9700.8850.8820.9830.9970.9990.9940.9970.9970.995

2.2 第6代与第8代牙髓干细胞标志物测定 第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙牙髓干细胞标志物CD44、CD29、CD90、CD73、CD146、CD105表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

类别CD44CD29CD90CD73CD146CD105第6代乳牙99.52±1.4899.32±1.5799.44±1.6297.43±1.4596.23±1.9497.99±1.48第8代乳牙99.34±1.3699.31±1.6499.80±1.0397.66±1.5296.34±1.6398.04±1.50第6代恒牙99.32±1.5299.35±1.5999.84±1.0698.01±1.6095.98±1.7198.31±1.16第8代恒牙99.63±1.4499.41±1.6299.40±1.1398.15±1.5496.49±1.6898.42±1.25F值0.0640.0060.2100.2760.2160.141P值0.9780.9990.8880.8420.8840.934

2.3 第6代与第8代牙髓干细胞唾液腺分泌相关分子基因表达 MR1在第6代恒牙牙髓干细胞中表达水平最高，其次为第6代乳牙，第8代乳牙与第8代恒牙表达水平相当。MR3在4组中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。AQP5在第6代乳牙、第8代乳牙、第6带恒牙中的表达水平相似，显著高于第8代恒牙(P<0.05)。β1-AR在第6代恒牙中的表达水平最高，显著高于其他3组(P<0.05)。β2-AR在第6代乳牙中的表达水平最高，其次为第6代恒牙，第8代乳牙表达水平最低，显著低于其他3组(P<0.05)。α-淀粉酶在第6代恒牙中表达水平最高，其次为第8代恒牙，显著高于第6代乳牙与第8代恒牙，差异有统计学意义(P<0.05)。黏蛋白5B在第6代恒牙中表达水平最高，其次为第6代乳牙，第8代乳牙，第8代恒牙的表达水平最低，4组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

类别MR1MR3AQP5β1-ARβ2-ARα-淀粉酶黏蛋白5B第6代乳牙1.05±0.310.13±0.061.05±0.310.93±0.200.95±0.330.98±0.320.97±0.30第8代乳牙0.68±0.210.10±0.031.09±0.320.89±0.220.25±0.070.81±0.350.80±0.26第6代恒牙2.94±0.550.12±0.051.06±0.292.81±0.640.84±0.281.94±0.412.62±0.48第8代恒牙0.62±0.180.09±0.030.31±0.080.78±0.520.64±0.221.62±0.400.40±0.11F值60.5661.01311.91129.6159.46312.28057.371P值0.0000.4080.0000.0000.0000.0000.000

3 讨论

3.1 干细胞分析 干细胞(stem cells)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞[5]。在一定条件下，它可以分化成多种APSC多能细胞，是一类具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。多能干细胞(Ps)具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制[6]。

3.2 牙髓干细胞 牙髓干细胞无论从数量上，还是分离培养方法上，均具有成为该细胞库的潜能[7]。牙髓属于结缔组织，有一定的修复再生能力，因成牙本质细胞属于终末细胞，一旦分化，就不再分裂，因此，一般认为牙本质细胞受损后，牙髓内未分化前提细胞能分化为成牙本质细胞[8,9]。目前认为牙髓干细胞可能来自血管周围微环境。牙髓干细胞体外培养发现其具有高度增生能力与自我更新能力[10,11]。在本次研究中，第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙增殖趋势相似，在第9天进入平台期，并且干细胞标记物表达水平没有显著差异，这提示不同代次的乳牙与恒牙牙髓干细胞一般生物学特性详细。

3.3 牙髓干细胞唾液腺分泌相关分子基因表达 唾液腺分泌受腺上皮细胞表达的MR与AR调控，MR激活可调节AQP5，调节水的快速转运。MR、AQP5可衡量唾液腺水分泌功能。α淀粉酶、黏蛋白是唾液中重要的蛋白质，其分泌受β-AR调控[12]。对不同代次乳牙与恒牙牙髓干细胞中唾液腺分泌相关分子的基因表达水平进行分析，结果显示MR1在第6代恒牙牙髓干细胞中表达水平最高，其次为第6代乳牙，第8代乳牙与第8代恒牙表达水平相当。MR3在4组中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。AQP5在第6代乳牙、第8代乳牙、第6带恒牙中的表达水平相似，显著高于第8代恒牙(P<0.05)。β1-AR在第6代恒牙中的表达水平最高，显著高于其他3组(P<0.05)。β2-AR在第6代乳牙中的表达水平最高，其次为第6代恒牙，第8代乳牙表达水平最低，显著低于其他3组(P<0.05)。α-淀粉酶在第6代恒牙中表达水平最高，其次为第8代恒牙，显著高于第6代乳牙与第8代恒牙，差异有统计学意义(P<0.05)。黏蛋白5B在第6代恒牙中表达水平最高，其次为第6代乳牙，第8代乳牙，第8代恒牙的表达水平最低，4组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。这结果提示第6代乳牙、第8代乳牙以及第6代恒牙、第8代恒牙均有不同水平的唾液腺分泌相关分子基因表达，虽然第6代恒牙在MR1、β1-AR、α-淀粉酶、黏蛋白5B表达水平更高一些，但第6代乳牙相关基因的表达也相对稳定，并且乳牙牙髓干细胞相对于恒牙，更容易获得。

3.4 第6代与第8代牙髓干细胞标志物测定 CD44、CD29、CD90、CD73、CD146、CD105是牙髓干细胞的常见标志物，可在牙髓干细胞中完全表达，可在一定程度上对口腔疾病进行有效判断。本研究显示，恒牙与乳牙牙髓干细胞生长情况与干细胞标记物相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，恒牙与乳牙牙髓干细胞生长情况与干细胞标记物没有显著差异。第6代与第8代乳牙及恒

牙表达不同水平的唾液腺分泌相关分子基因，为唾液腺功能低下的治疗提供了新的可能，并且乳牙牙髓干细胞更容易获得，有望成为理想的组织工程种子细胞。