非小细胞肺癌患者HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b表达与生存期限的关系

朱立欢 王志安 熊汉忠 谢芳

在恶性肿瘤中，肺癌是全球死亡率最高的。肺癌的发病率每年超过160万例，占所有癌症新诊断病例的13%，每年有140万人死亡，占所有癌症相关死亡人数的18%[1]。在中国，与肺癌有关的死亡率和发病率每年都在增加[2]。80%以上肺癌的病理类型是非小细胞肺癌(NSCLC)。有些患者在手术后早期就有复发的危险，在化疗和靶向治疗过程中会出现耐药性[3]。因此，需要更好地了解产生耐药性的原因以及如何克服这种原因。非小细胞肺癌的分子机制尚不清楚，目前正在进行广泛的研究[4]。实时定量RT-PCR(qPCR)技术在非小细胞肺癌的早期诊断、预后预测和基因表达分析等方面具有重要的应用价值[5]。许多基因与非小细胞肺癌的发生有关，如p53、Rb和Ras[6]。一项研究表明，186个microRNAs中有98个位于肿瘤相关基因组区或易碎位点[7]。例如，miR-99 a、let-7、miR-125 b-2位于肺癌的纯合子缺失区，没有已知的抑癌基因[8， 9]。一些microRNAs位于断点的附近，其中miR-142位于涉及17号染色体和MYC的t断裂的50个核苷酸处。这表明microRNAs可能在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。此外，microRNA的表达谱显示许多肿瘤类型的特征性特征，是肿瘤分类、预后和治疗结果的生物标志[9]。研究表明，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b可通过调节CrK、VEGF和EGFL 7在NSCLC中抑制侵袭和增殖[10]。因此，目前证据似乎支持HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b与肿瘤生长相关。此外，与卡培他滨和奥沙利铂一线治疗无效患者相比，服用卡培他滨和奥沙利铂的患者HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表达水平显著升高[11]。基于上述报道，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b可能对癌症有可能的预测和诊断价值[12]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 患者术前未接受放疗和(或)化疗。选择2015年1月至2018年10月，98例新诊断的NSCLC患者和98例年龄和性别匹配的健康对照者。分别采集患者3 ml血，30 min内分离血清，-80℃保存，进行分析。收集后，所有组织样品立即储存在液氮中，直到使用。患者2015至2018年随访，平均观察44个月。根据美国癌症联合委员会(AJCC)的标准确定临床和临床病理分级和分期。

1.2 miRNA定量实时PCR(qrt-PCR) 用Trizol试剂按生产工艺从血清中提取总RNA，在-80℃保存，待进一步加工。用100 ng总RNA合成cDNA。根据制造商的说明，使用Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR试剂盒(Ribobio)对HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b进行qRT-PCR。简单地说，利用特定的HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b正向引物和U6的反向引物，从总RNA中合成了HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b和U6特异性的cDNA，然后利用ABI-Prism 7 900 HT系统(Applied Biosystems)进行了实时PCR和一个特定于HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的前向引物和一个通用的反向引物。每个样本一式三份。以U6小核RNA为内源对照。计算每个样本的HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表达水平，用ΔCT值表示。用比较2ΔΔCT法分析同一患者成对组织中的HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的相对表达水平。

1.3 Western blotting 用细胞裂解缓冲液从培养细胞中提取总蛋白，然后在冰浴中孵育60 min，低温离心15 min(12 000 r/min)。取上清液测定蛋白质浓度。用100 μg蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用抗HSA-miR30-5p抗体和小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体(GAPDH；1∶1 000；Abgent， CA， USA)在4℃上孵育一夜。膜用含吐温-20的3次0.9%氯化钠溶液冲洗3次(每次10 min)。加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶结合羊抗兔IgG抗体(二次抗体)，室温孵育1.5 h。薄膜用吐温-20洗3次。在凝胶成像系统中加入电化学发光试剂进行信号处理，用于图像采集。相对HSA-miR30-5p含量以HSA-miR30-5p/GAPDH的灰度比值表示。用Quantity One software (Bio-Rad Laboratories， CA， USA)进行灰度分析。

1.4 细胞侵袭和细胞增殖实验 跨孔细胞培养室(Millipore，Bedford，MA，USA)用基质包覆，37℃干燥后用培养基进行重组。细胞分为3组：对照组、PE-CMV组和PE-MIL 126组。转染PE-CMV或PE-MIR 126的细胞在无血清培养基中饥饿，在RMPI 1640培养基中以1×106/ml悬浮24 h。将300 ml细胞悬液置于上腔，37℃时允许迁移24 h。下腔室中的悬浮介质被移除。侵入滤器下部的细胞用4%多聚甲醛固定，用Gimsa溶液染色。在相差显微镜下，计算进入下腔的细胞数量。用10%FBS和100 mg/ml青霉素/链霉素在RMPI 1640中接种96孔板，培养72 h。3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四氮唑溴(MTT)法测定细胞增殖率。

1.5 酶联免疫吸附测定法 人IL-4、IL-10、IL-21和干扰素γ(IFN-γ)ELISA试剂盒从eBioscience购买。人IGM、IgG和IgA试剂盒从ABCAM购买。所有的ELISAs都是按照制造商的指示执行的。

2 结果

2.1 患者特征 本研究包括男70例，女28例；年龄32～75岁，平均年龄(54.37±10.77)岁；Ⅰ期15例，Ⅱ期14例，Ⅲ期25例，Ⅳ期44例；远处转移44例；吸烟者23例，不吸烟者54例。见表1。

表1 非小细胞肺癌患者的人口学特征

注：TNM：肿瘤淋巴结转移

2.2 HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表达与NSCLC 免疫组化结果提示HSA-miR30-5p主要位于细胞浆内。非小细胞肺癌组织中HSA-miR30-5p阳性表达率高于正常肺组织(70.8% vs 47.5%，Pearson’s χ2=13.521，P<0.01)。HSA-miR30-5p在腺癌和鳞癌组织中的阳性表达率分别为73.1%和67.9%。随机抽取40例非小细胞肺癌组织标本和正常肺组织进行验证。此外，用Western印迹法检测HSA-miR30-5p蛋白的表达水平。HSA-miR30-5p在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于正常肺组织(P<0.01)。见图1。

图1 Western blotting定量检测HSA-miR30-5p蛋白

注：图中1、2分别为正常对照组与NSCLC患者组表达结果；泳道A、C为已知的NSCLC敏感基因miR-142表达结果，泳道B、D分别为HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b表达结果

2.3 HSA-miR30-5p表达和NSCLC患者的临床病理特征 根据免疫组化结果，将NSCLC患者分为阳性表达组和阴性表达组。分析非小细胞肺癌(NSCLC)患者HSA-miR30-5p表达与临床特征的关系。HSA-miR30-5p阳性表达与淋巴结转移及肿瘤分期密切相关(均P<0.05)，但与年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小、病理类型及分化程度无关(均P>0.05)。见表2。

2.4 HSA-miR30-5p表达与NSCLC患者预后分析 随访时间49～105个月，中位数81个月。Kaplan-Meier生存模型显示，HSA-miR30-5p阳性表达组的存活时间明显短于阴性表达组。分化较差、淋巴结转移和晚期TNM分期的患者预后较差。见表3。

2.5 HSA-LIT-7b在NSCLC中的表达水平 在98例非小细胞肺癌患者中， HSA-LIT-7b的表达水平与性别、年龄、组织学类型或肿瘤分期无关。根据HSA-LIT-7b的表达水平分为2组：微RNA表达水平低于中位数的组和高于或等于HSA-LIT-7b表达水平中位数的组(中位数：0.654)。然而，Kaplan-Meier生存分析显示，低表达的患者与高表达的患者相比，存活时间明显缩短(P=0.005)。见表2、4。

表2 非小细胞肺癌患者HSA-miR30-5p的表达及临床病理特征 例(%)

表3 98例非小细胞肺癌患者的整体生存情况

项目miR126P值性别 男(n=70)0.65±0.340.958 女(n=28)0.64±0.330.958年龄(岁) ≤55(n=55)0.65±0.320.786 >55(n=43)0.68±0.290.786是否吸烟 是(n=54)0.68±0.310.384 否(n=44)0.66±0.330.384组织学类型 腺癌(n=55)0.68±0.350.666 鳞状细胞癌(n=43)0.66±0.310.666TNM分级 Ⅰ级(n=15)0.67±0.330.298 Ⅱ级(n=14)0.68±3.310.298 Ⅲ级(n=25)0.62±0.340.298 Ⅳ级(n=44)0.71±0.320.298

2.6 HSA-LIT-7b基因型的多态性及其与非小细胞肺癌的关系 我们对442例非小细胞肺癌患者和543例对照组的基因组DNA片段进行了测序，其中包括Pre HSA-LIT-7b及其相应的侧翼区(6 200 Bp)。3个SNP分别为rs78 242 242、rs4 636 297和rs1 140 713。在本研究中，由于频率很低，rs78 242 242和rs1 140 713没有进行统计分析(数据未显示)。正常对照组SNP(G>A，rs4 636 297)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.336)，2组基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 HSA-LIT-7b多态性的基因型及其与非小细胞肺癌的关系

3 讨论

在本研究中，我们尝试鉴定NSCLC患者无细胞HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b mRNA的表达。在肺癌中，非小细胞肺癌占所有病例的80%～85%，超过70%的患者被诊断为晚期肺癌。实验表明HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b参与肿瘤的形成和进展[13]。在乳腺癌、头颈部和肺恶性肿瘤中，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的过表达与预后和转移密切相关。HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的过表达已被报道并与包括NSCLC在内的许多人类恶性肿瘤的发病机制有关[14]。

有研究者还分析了HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在非小细胞肺癌中的表达与生存率降低有关[15]。本研究中，我们观察到HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b基因的高表达与NSCLC患者的生存不良有关。我们观察到不同时期的基因表达水平有显着性差异。Ⅳ期、Ⅲ期和Ⅱ期患者的基因表达分别是Ⅰ期的4.5倍、3.63倍和1.73倍。当患者的总生存期较<13倍和>13倍的患者基因表达增加，发现基因表达>13倍的患者总生存率比<13倍的患者降低2.35倍。基因表达增加13倍以上的远处转移患者总生存率比基因表达增加<13倍的患者降低1.58倍。此外，基因表达增加13倍以上的非转移患者总生存率降低1.28倍，远处转移患者基因表达增加13倍以上，总生存率下降2.53倍。在各种研究中，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在胰腺癌中的高表达率在30%～95%，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表达与局部晚期和转移性疾病相关。在NSCLCs，尤其是腺癌中，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在70%的患者中过度表达。HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在晚期非小细胞肺癌患者中高表达，与生存不良有关，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表达与肺癌的发病机制密切相关。有研究者在他的研究中指出HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表达水平可以作为NSCLC的预后和预测指标[16]。HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b被发现是一个转移能力的区域，并被认为促进癌细胞的迁移和侵袭。它的表达已在多种人类恶性肿瘤中检测到，包括高达50%～78%的乳腺癌[17]。据报道，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在胃癌、乳腺癌等实体肿瘤中有较高的表达[18]。

在本研究中，我们认为无细胞HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7bmRNA的表达可能是NSCLC患者整体生存和肿瘤恶性转移行为的预测因素。