广西产桑叶调节血脂作用及成分鉴定研究*

曾 瑜，李远杰，马健雄，陈 路

（1. 广西医科大学第四附属医院·柳州市工人医院，广西 柳州 545005； 2. 广西金海堂药业有限责任公司，广西 南宁 530313； 3. 广西药用植物园，广西 南宁 530023）

桑叶为桑科植物Morus albaL. 的干燥叶，桑叶及其制剂具有降血糖、降血压、抗菌、抗病毒等多种药理活性[1-4]，但调节血脂方面的研究较少，特别是关于血清药物成分研究目前尚未见相关报道。广西是我国桑叶主产地之一，药材资源丰富，以桑叶为主药制成的药品制剂和药食两用的食品品类繁多，但质量参差不齐，其中药材质量标准不够完善是主要原因。本研究中对桑叶提取物调节血脂作用进行研究，对比了水提物、醇提物及水提物+醇提物混合给药的调脂效果，明确了桑叶提取物入血成分，为完善桑叶药材的质量标准及开发调脂类食品制剂提供参考。现报道如下。

1 仪器、试药与动物

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（HPLC），G6530 型四级杆串联飞行时间质谱（Q-TOF/MS）仪均购自美国安捷伦公司；Allegra 64R 型低温高速离心机（美国Beckman 公司）；EL204 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司）；Milli Q 超纯水仪（美国密理博公司）；试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司）。

1.2 试药

桑叶采摘于广西南宁市郊，经广西中医药大学药用

植物教研室韦松基教授鉴定为正品；桑叶提取物（实验室自制，为浓缩液冷冻干燥的粉末）；银杏黄酮片（深圳海王药业有限公司，批号为20161009）；槲皮素对照品、山柰酚对照品、山柰酚芸香苷对照品、紫云英苷对照品、槲皮素芸香苷对照品、木犀草素芸香苷对照品、绿原酸对照品（批号分别为201607，201611，201606，201607，201602，201606，201607，纯度均≥98%），均购自中国食品药品检定研究院；Triton WR-1339（美国Sigma-Aldrich 公司）；乙腈为色谱纯（美国Fisher 试剂公司），其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

160 只SPF 级健康昆明种小鼠，体质量（20±2）g，雌雄各半，购于广西中医药大学实验动物中心（合格证号为桂医动字第11005 号）。实验动物给予普通饲料分笼饲养1 周以适应实验条件。饲养环境温度为22 ～27 ℃，相对湿度为50% ～70%。

2 方法与结果

2.1 调节血脂作用实验

2.1.1 急性高脂血症小鼠模型建立与给药

将实验小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、实验组和阳性对照组，模型对照组、实验组和阳性对照组分别尾静脉注射Triton WR-1339（400 mg/kg）诱导血脂升高；正常对照组注射等体积生理盐水。注射Triton WR-1339 后12 h，实验组[水提物组、醇提物组、水提物组+醇提物组（1 ∶3）]分别用桑叶提取物（10，20，40 mg/kg 3 个剂量组）灌胃，阳性对照组以银杏黄酮（20 mg/kg）灌胃。给药后6，12 h，每组各随机选取10 只小鼠，去眼球采血分离血清，于-38 ℃保存，备用。

2.1.2 血脂指标测定

按照试剂盒说明书进行操作，分别测定各组血清样品中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的含量，并计算HDL-C/TC 及HDL-C/LDL-C。采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。数据以表示，组间比较用t检验，P＜0.05 为差异有显著性。结果见表1。与正常对照组相比，其余各组小鼠注射Triton WR-1339 后，小鼠血清中TC，TG，LDL-C 均较注射前分别升高7.5，6，4 倍，HDL-C/TC 和HDL-C/LDL-C 分别降低41%和12%，可见小鼠造模成功。注射Triton WR-1339 后12 h，各组小鼠血清中TC，TG，LDL-C，LDL-C 水平比较，无显著性差异（P＞0.05）。实验组各组给药后12 h，桑叶水提物、桑叶醇提物和桑叶水提物+桑叶醇提物均能降低由Triton WR-1339诱发的高脂血症，且呈剂量依赖性，给药剂量越大效果越好。可见，实验组3 组中以混合给药调脂效果最好，混合给药高剂量组的效果显著超过阳性对照组（P＜0.01）。

表1 给药后12 h 桑叶提取物对急性高脂血症小鼠血脂指标的影响（±s，n=10）

表1 给药后12 h 桑叶提取物对急性高脂血症小鼠血脂指标的影响（±s，n=10）

注：与正常对照组相比，*P ＜0.01；与模型组相比，#P ＜0.05；实验组A/B/C 给药剂量分别为10，20，40 mg/kg。

指标TC（mg/100 mL）TG（mg/100 mL）LDL-C（mg/100 mL）HDL-C/TC HDL-C/LDL-C正常对照组80.6±3.9 86.3±4.1 73.2±5.7 0.54±0.03 0.59±0.04模型组468.4±35.9*548.5±36.7*321.3±23.8*0.35±0.02*0.51±0.02阳性对照组318.6±36.2 452.8±38.4 230.7±18.3 0.39±0.03 0.55±0.02水提物组432.3±18.9/402.2±19.3/318.4±21.9#537.2±36.4/512.2±39.7/443.6±42.7#296.3±21.5/279.8±26.5/223.6±25.3#0.35±0.03/0.36±0.04/0.38±0.03 0.51±0.03/0.52±0.02/0.54±0.02实验组（A/B/C）醇提物组374.6±42.1/323.9±31.4/285.4±22.3#528.2±49.4/501.5±49.1/421.7±26.8#258.7±28.6/224.5±21.2/201.2±10.1#0.36±0.03/0.37±0.04/0.39±0.03 0.52±0.02/0.53±0.03/0.55±0.02（水提物+醇提物）组371.1±37.4/289.6±38.2/217.3±29.8#508.2±24.7/451.4±31.7/398.3±35.4#257.9±19.5/203.8±13.2/163.6±21.7#0.37±0.04/0.39±0.05/0.43±0.03#0.53±0.03/0.55±0.04/0.57±0.05

2.2 血清药物成分分析

2.2.1 溶液制备

取桑叶水提物+桑叶醇提物（1 ∶3）0.510 6 g，精密称定，用50%甲醇溶解，超声10 min，置离心机，速率13 000 r/min 离心10 min，取上清液作为供试品溶液。分别取2.1.1 项下实验组（混合给药组）的小鼠血清置离心机重新，速率13 000 r/min 离心10 min（25 ℃），取上清液作为血清样品溶液。取山柰酚芸香苷等对照品适量，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成相应质量浓度的混合对照品溶液，低温保存，作为对照品溶液，备用。

2.2.2 成分分析

色谱柱为Agilent RRHD Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为90%乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）梯度洗脱[0 ～10 min 时A-B（20 ∶80），10 ～20 min时A-B（30 ∶70），20 ～30 min 时A-B（40 ∶60）]，流速为1.0 mL/min，检测波长为365 nm。质谱采用AJS ESI源，扫描方式为正、负离子模式，采集范围为m/ z100 ～1 700。

取上述溶液，按拟订色谱条件进样分析，并结合文献及质谱信息初步确定桑叶提取物降血脂入血成分。结果见表2 和图1。在小鼠血清样品中检测出9 个入血成分，鉴定了7 个成分，其中3 个原形成分，4 个代谢产物。9 个入血成分主要为黄酮类化合物。

化合物1：在负离子模式下得到准分子离子m/ z353.0，碎片离子m/ z191.3[M-162]-可能是奎尼酸的特征峰，为准分子离子失去1 分子咖啡酸基团而得，推测为绿原酸的裂解途径，通过与文献[5]及绿原酸对照品比较，鉴定化合物1 为绿原酸。

化合物2：准分子离子m/ z611.0，准分子离子失去1 分子芸香糖后的碎片为m/ z303.4，是黄酮类化合物典型的裂解途径，通过与文献[6]及槲皮素芸香苷对照品比较，鉴定化合物2 为槲皮素芸香苷。

表2 桑叶提取物入血成分谱峰信息归属

图1 高效液相色谱图

化合物3：准分子离子m/ z611.0，推断为化合物2 的同分异构体，准分子离子失去1 分子芸香糖后再失去1 个O·得到碎片离子m/ z287.4，通过与文献[6]及木犀草素芸香苷对照品比较，鉴定化合物3 为木犀草素芸香苷。

化合物4：准分子离子m/ z595.0，其余碎片离子与化合物3 相似，推测化合物4 是由化合物3 失去1 个O·而得，通过与文献[7]及山柰酚芸香苷对照品比较，鉴定化合物4 为山柰酚芸香苷。

化合物5：准分子离子m/ z449.0，有1 个m/ z287.4 的碎片离子，与化合物3 和4 相似，推测化合物5由化合物3 或化合物4 失去1 分子呋喃糖（m/ z162.0）而得，通过与文献[8]及紫云英苷对照品比较，鉴定化合物5 为紫云英苷。

化合物7 和化合物9：两者的准分子离子峰在化合物2 和4 的碎片离子中均有出现，推测为化合物2 和4的母核，通过与文献[5]及槲皮素、山柰酚对照品比较，鉴定化合物7 为槲皮素，化合物9 为山柰酚。

3 讨论

血清药物化学于1989 年由日本学者田代真一提出，是血清中药效物质较科学、有效的研究方法，也是中药药效物质基础研究的重要手段。近年来，该研究方法在国内迅速发展，许多专家、学者做了大量的研究，为阐明中药物质基础及作用机制作出了贡献[9-10]。高脂血症是导致动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）等心脑血管疾病的危险因素之一，是中老年人的常见病、多发病[11]。现代研究发现，桑叶提取物能显著拮抗急性高脂血症小鼠中的TC，TG，HDL-C 升高，对动脉粥样硬化和冠心病等疾病有一定的预防作用[12-14]。血清药物分析能精准确定发挥药效的具体物质成分，在中药研究方面也初见成效，对药材质量标准的完善和深度开发有重要作用[15-16]。

本研究中仍有几个值得注意的问题。一是在进行调节血脂实验时，混合给药组的水提物与醇提物的混合比例。在前期实验中曾尝试了水提物+醇提物（1 ∶1，1 ∶2，1 ∶3，2 ∶1，3 ∶1）多种混合比例，发现混合比例不同调脂效果不一样，其中以水提物+醇提物（1 ∶3）效果最好。二是血清的取样和采集时间。有学者在研究血药成分时直接用健康小鼠给药后采集血清，因涉及健康体和带病体对药物摄取是否一致，科学性还需要进行更深入的研究探讨。为保证实验条件的一致性和更具有针对性，本研究中采用的是给药后6 h 的小鼠血清，此时血药浓度最高，对血药成分分析较有利。三是在成分鉴定方面，血清中同时检测出黄酮苷和苷元。但从图谱信息来看，苷元的含量极少，可能是尚未代谢完成的遗留成分。另有2 个化合物尚未鉴定出来，但根据生源途径及离子碎片分析，初步推测为黄酮类或绿原酸衍生物，将在下一步工作结合更多的色谱技术对其进行解析。