miR-622在上皮性卵巢癌组织的表达差异及其机制

2020-03-14袁冠华郑锐年

实用医学杂志 2020年2期

袁冠华郑锐年

广东省南方医科大学附属东莞市人民医院1 妇产科，2 肿瘤内科（广东东莞523000）

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，据统计，约90%的卵巢癌为上皮性卵巢癌[1]。由于卵巢组织较为隐蔽，早期并没有明显的症状，多数患者确诊时已经为晚期，而且卵巢癌具有侵袭转移能力强、复发率高、易产生耐药性等特点，预后效果较差，病死率高[2]。microRNA是在真核生物细胞体内广泛存在的高度保守短链RNA，由22～23个核苷酸组成，通过靶向结合目标靶基因mRNA的3′-UTR 区，在转录后水平抑制靶基因表达，具有调节细胞分化、增殖以及凋亡的分子功能[3-4]。近年来，多项研究表明，microRNA 与人类多种恶性肿瘤的发生、发展进程以及患者预后密切相关[5-6]。miR-622 作为近年来新发现的与肿瘤相关microRNA家族重要成员之一，在结直肠癌[7-8]、胃癌[9]、肾癌[10]、甲状腺癌[11]、胆管癌[12]、卵巢癌等[13-15]多种恶性肿瘤组织或细胞均具有异常表达，且参与了肿瘤细胞的恶性演进等过程。然而，miR-622 参与卵巢癌细胞的发生、发展进程等生物分子机制鲜有报道。本研究主要探究miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK多种蛋白在卵巢癌组织的表达情况，通过体外细胞转染技术研究miR-622与KRAS、MAPK1、p-ERK多种蛋白的调控关系，旨在探究miR-622 参与卵巢癌细胞的发生、恶化进展的作用机制，为卵巢癌机制研究及基因治疗提供资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料连续选取我院于2018年度经确诊为卵巢上皮性癌患者共80例，卵巢上皮性良性瘤40例，正常卵巢组织30例，每位患者都签署知情同意书。卵巢上皮性癌选人标准：初次手术，之前未接受放化疗，术后经病理学确诊为上皮性卵巢癌患者。排除标准：合并其他严重疾病者，如免疫性疾病患者、严重精神病患者、确诊为其他恶性肿瘤患者等。卵巢上皮性良性瘤患者年龄（52.5± 6.5）岁，其中黏液性腺瘤18例，浆液性腺瘤22例。正常卵巢组织患者年龄（57.8 ± 7.3）岁，均取自卵巢切除且病理确诊无异常患者。

1.2 方法

1.2.1 提取和检测RNARNA 提取与检测按照TRIZOL 试剂盒说明书方法提取组织总RNA，并采用紫外分光光度计检测提取RNA的浓度与纯度，以A280/A260 作为合格标准。应用miRcute miRNA 第一链合成试剂盒对提取的总RNA 逆转录成cRNA，采用miRcute miRNA qPCR 试剂盒进行PCR产物扩增。miR-622 上游引物以及内参U6 上游引物分别购自于北京优宁康生物公司以及北京嘉美纽诺生物公司。PCR 反应参数：预变性95℃15 min，变性95℃20 s，退火60℃30 s，72℃延伸10 s，共扩增40个循环，采用2-ΔΔCT方法计算miR-622 相对表达量。

1.2.2 测量KRAS蛋白、MAPK1蛋白以及p-ERK蛋白的相对表达水平免疫组化实验应用免疫组化SP 法测量组织样品的KRAS蛋白、MAPK1蛋白以及p-ERK蛋白的相对表达水平。所有样品都用10%的中性福尔马林液进行固定，用石蜡包埋后作成4 μm的连续切片，并进行防脱处理，后严格按照SP 法进行检测。参照Prugger 等方法，根据细胞染色比例，制定评分标准[16]：0 分为0～1%阳性细胞、1 分为1%～10%阳性细胞、2 分为10%～50%阳性细胞、3 分为50%～75%阳性细胞、4 分为75%～100%阳性细胞。根据细胞染色强度，制定评分标准：0为未染色细胞、1 分为淡黄色细胞、2 分为棕黄色细胞、3 分为棕褐色细胞。最后将两种评分两两相加计算最后总分，得分范围为0～7 分。

1.2.3 细胞培养与转染细胞培养与转染人卵巢癌SKOV3细胞株来自于中国科学院细胞库，加入1640 培养基+10%胎牛血清，置于培养箱，培养箱环境设置条件为恒温37℃、5%CO2以及95%空气。应用脂质体（Lipofectami-neTM3000）作为载体分别将miR-622 模拟物（miR-622 上调组）、阴性对照物转染至SKOV3细胞株（miR-622 下调组），仅以脂质体试剂转染作为空白对照组（miR-622对照组）

1.2.4 Western Blot实验细胞转染培养Western Blot实验细胞转染培养48 h后，用蛋白裂解液（PIPA）对细胞进行裂解并分别提取3 组细胞的总蛋白，用Bradford 法测定细胞蛋白浓度，蛋白质样品经过水浴变性后进行SDS-PAGE 电泳分离，后转至PVDF 膜上。用5%脱脂牛奶对PVDF 膜封闭1～2 h，分别加入KRAS、MAPK1 以及p-ERK 一抗以及适量封闭液，放置4℃冰箱过夜。加入二抗，室温下孵育2 h，在暗室采用ECL 化学发光发检测，压片显影。显示结果于X 光片，扫描图片，并计算结果。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0 统计软件进行分析统计，计量资料采用表示，比较两者之间差异采用t检验方法，比较三者之间差异采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MiR-622以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在3 组组织的表达3 组组织的miR-622表达以及多种蛋白表达差异均具有统计学意义（P＜0.05），卵巢癌组织中的miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK多种蛋白均明显高于正常卵巢组织以及良性瘤组织（P＜0.05），而良性瘤组织与正常卵巢组织差异没有统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 MiR-622 与KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在卵巢癌组织表达与相关关系卵巢癌组织中的miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK 蛋白表达水平与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤病理类型无关（P＞0.05），FIGO 处于Ⅲ-Ⅳ期以及发生淋巴结转移时，miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表达水平升高（P＜0.05），此外，KRAS蛋白在中低分化以及黏液性卵巢癌呈高表达（P＜0.05）。见表2。

表1 miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在不同组织的表达Tab.1 The expression of miR-622，KRAS，MAPK1，p-ERK in different issure±s

注：与正常卵巢组织对比，*P ＜0.05

指标正常卵巢组织良性瘤组织卵巢癌组织F 值P 值例数30 40 80 miR-622 相对表达2.02±0.22 2.05±0.21 2.45±0.41* 60.33＜0.001 KRAS蛋白/分1.67±0.49 1.75±0.51 3.89±1.12* 126.81＜0.001 MAPK1蛋白/分1.62±0.45 1.64±0.49 4.05±1.58* 62.77＜0.001 p-ERK蛋白/分1.17±0.22 1.21±0.24 3.08±1.19* 104.93＜0.001

表2 miR-622 与KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白和卵巢癌临床病理参数的关系Tab.2 The relationship between miR-622 and KRAS，MAPK1，p-ERK，pathological parameters of ovarian cancer±s

注：*P ＜0.05

FIGO 分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期病理类型浆液性腺癌黏液性腺癌分化程度高分化中低分化淋巴结转移否是28 52 59 21 29 51 45 35 2.01±0.15 2.89±0.49* 2.40±0.30 2.50±0.34 2.38±0.31 2.52±0.33 2.28±0.23 2.62±0.41* 3.52±0.89 4.26±1.15* 3.59±0.91 4.19±1.13* 3.48±0.86 4.30±1.18* 3.51±0.89 4.27±1.15* MAPK1蛋白/分4.01±1.50 4.09±1.54 4.11±1.56 3.99±1.48 3.68±1.22 4.42±1.82* 4.01±1.35 4.09±1.69 3.99±1.45 4.11±1.59 3.61±1.32 4.49±1.72* p-ERK蛋白/分3.01±1.00 3.15±1.16 3.18±1.21 2.98±0.95 2.78±0.82 3.38±1.34* 3.04±0.95 3.12±1.21 3.01±0.91 3.15±1.25 2.58±0.73 3.58±1.43*

2.3 MiR-622 调控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表达Western Blot检测结果显示，3组样本的miR-622 以及多种蛋白相对表达量差异均具有统计学意义（P＜0.05），与miR-622对照组相比，miR-622上调组中的KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表达水平明显增加（P＜0.05），而miR-622 下调组中的KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白水平表达明显减少（P＜0.05）。见表3、图1。

表3 miR-622 调控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表达Tab.3 The expression of KRAS、MAPK1、p-ERK controlled by miR-622±s

注：*P ＜0.05

指标miR-622对照组miR-622下调组miR-622上调组F值P值miR-622相对表达2.68±0.51 0.23±0.09* 12.55±1.12* 1 161.85＜0.001 KRAS蛋白0.53±0.05 0.24±0.03* 0.78±0.11* 248.20＜0.001 MAPK1蛋白0.62±0.08 0.31±0.03* 0.94±0.13* 111.42＜0.001 p-ERK蛋白0.59±0.05 0.15±0.01* 0.89±0.12* 372.60＜0.001

3 讨论

图1 miR-622 调控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表达Fig.1 The expression of KRAS、MAPK1、p-ERK controlled by miR-622

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，目前发病机制尚未完全清楚，据统计研究，晚期患者 5年生存率不到30%[17-18]。由于缺乏早期有效的筛查方法，大多数病人在确诊后都已到晚期，癌细胞已广泛转移。因此，卵巢癌早期的诊断以及治疗方法是当前探索的当务之急。近年，microRNAs是各个领域研究的重点方向之一，microRNA是在真核生物细胞体内广泛存在的高度保守短链RNA，由22～23个核苷酸组成，通过靶向结合目标靶基因mRNA的3′-UTR 区，在转录后水平抑制靶基因表达，具有调节细胞分化、增殖以及凋亡的分子功能。miR-622 作为近年来新发现的与肿瘤相关microRNA 家族重要成员之一，并且在多种恶性肿瘤有广泛的研究报道[19]。然而，miR-622在卵巢癌的国内外研究报道较少。至于miR-622是如何参与卵巢癌细胞的发生、恶性演进等鲜有研究报道。

在本研究中，结果显示miR-622在卵巢上皮性癌组织中的表达水平高于卵巢良性上皮性肿瘤组织和正常卵巢组织，miR-622在卵巢癌组织的表达与患者年龄、肿瘤大小、病理类型以及分化程度无关，仅与FIGO 分期以及是否淋巴结转移有关，FIGO处于Ⅲ～Ⅳ期miR-622表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期，发生淋巴结转移miR-622表达明显高于未转移状态，这可能与miR-622 上调能够促进卵巢细胞侵袭和转移能力有关。研究还发现KRAS、MAPK1、p-ERK多种蛋白在卵巢癌组织表达水平高于良性肿瘤组织和正常组织，FIGO 处于Ⅲ～Ⅳ期以及发生淋巴结转移时，KRAS、MAPK1、p-ERK 三种蛋白表达明显高于相应的FIGO 处于Ⅰ～Ⅱ期以及未发生淋巴结转移状态，此外还发现KRAS蛋白在中低分化以及黏液性卵巢癌呈高表达。KRAS在卵巢癌组织呈高表达，这与KURMAN 等[20]报道的KRAS基因突变在卵巢癌中较常见，多见于低分化，低FIGO 分期和黏液性组织类型一致，突变后的KRAS蛋白处于持续激活状态。MAPK1 与p-ERK蛋白在卵巢癌组织呈高表达可能与MAPK/ERK信号通路被激活有关。实验结果显示KRAS、MAPK1、p-ERK 三种蛋白可能都参与了卵巢癌恶化演进过程[21-22]。

MAPK/ERK信号通路是真核细胞普遍存在的信号通路，主要负责连接细胞外刺激到细胞内基因表达的通道。据统计，1/3 人类肿瘤发生与该通路的突变或激活密切相关，MAPK/ERK信号通路的激活可以引起肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的恶性演进。本实验结果显示，通过调节SKOV3细胞miR-622表达升高，可以调控细胞MAPK1、p-ERK蛋白表达升高，可能与MAPK/ERK信号通路的激活有关，具体机理有待下一步探究。研究还发现卵巢癌组织中的miR-622表达水平也明显高于正常或良性瘤组织，而且miR-622能够调控MAPK1以及p-ERK蛋白的表达，显示miR-622 与卵巢癌的发生密切相关。KRAS 基因突变在卵巢癌中较常见，KRAS 作为卵巢癌靶向基因之一，与卵巢癌的发生与恶性演进密切相关。研究结果表明调节SKOV3细胞miR-622表达升高，能够调控KRAS 基因蛋白表达的上升，进一步验证miR-622 与卵巢癌发生与恶性演进相关。张志方等[13]研究表明调节细胞miR-622 上升能够促进癌细胞迁移和侵袭能力，与本文研究结果一致。

综上所述，miR-622在上皮性卵巢癌组织中呈高表达，能够调控卵巢癌细胞中KRAS、MAPK1、p-ERK多种蛋白的表达，并且参与卵巢癌的发生以及恶性演进。