GPC-UPLC-MS/MS法测定植物油中的黄曲霉毒素

马作江，黄山，杨迪，谢义梅，单长海，蔡学

国家富硒产品质量监督检验中心，恩施土家族苗族自治州公共检验检测中心（恩施 445000）

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素，通过多种途径污染食品、粮油、饲料等，严重威胁人类健康[1-2]。目前已经发现的黄曲霉毒素有20余种，其中分布最广的是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2[3]，其结构稳定、含量低、要求相关检测方法特异性强、灵敏度高。黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法[4]、高效液相法[5-6]、酶联免疫吸附法[7]、液相色谱-质谱联用法[8-9]。液相色谱-质谱联用法是痕量组分定量分析的重要手段，具有高选择性和高灵敏度的优点，但对复杂基质样品的前处理要求较高。

黄曲霉毒素提取净化的常规方法主要有免疫亲和柱净化法[10]、固相萃取净化法[11]、薄层分离法等[4]。这些方法操作程序较为复杂、自动化程度不高，重现性、精密度等完全依赖操作人员的水平，对分析人员的要求较高。由于植物油等复杂样品中色素和油脂等物质含量较高，对后续的分析工作产生较大的干扰，这就对样品中目标化合物的提取和净化提出了更高的要求。相比于传统的净化手段，凝胶色谱净化（Gel Permeation Chromatography GPC）是基于目标物分子大小的一项分离技术，被广泛用于残留分析中样品的净化[12-13]，具有净化容量大、可重复使用、适用范围广、自动化程度高等特点，尤其在富含脂肪、色素等大分子的植物油等样品分离净化方面，具有明显的净化效果。试验研究了提取植物油样品中黄曲霉毒素残留的GPC前处理方法及仪器分析条件，建立了凝胶色谱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定植物油中四种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉毒素Aflatoxin B1、Aflatoxin B2、Aflatoxin G1、Aflatoxin G2（纯度≥98%），First Standard公司；黄曲霉毒素同位素内标物13C17-Afatoxin B1、13C17-Afatoxin B2、13C17-Afatoxin G1、13C17-Afatoxin G2（纯度≥98%），ISOREAG公司；乙腈（LC-MS级）、乙酸乙酯（色谱纯）、环己烷（色谱纯），美国MREDA公司；甲酸（LC-MS级），美国Fisher公司；超纯水为Milli-Q纯水机制备所得；0.22 μm微孔滤膜，美国Ameritech公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联四极杆液质联用仪Agilent 1290/6460 UPLC/MS/MS，配有电喷雾离子源（ESI）及MassHunter工作站数据系统数据处理系统，美国Agilent公司；氮气发生器NM32LA，英国PEAK公司；全自动凝胶色谱净化浓缩联用仪The FREESTYLETMGPC-EVA，德国LC-Tech公司；氮气吹干仪N-EVAP-112，美国Organomation公司；分析天平Quintix 224-1cn，德国赛多利斯公司；Milli-Q Integral5纯水/超纯水一体化系统，德国Merck Millipore公司；超声波清洗机SB25-12D，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验条件

1.3.1 试剂的配制

混合标准及内标工作液：分别用乙腈将黄曲霉毒B1、黄曲霉毒B2、黄曲霉毒G1、黄曲霉毒G2标准物质储备溶液（100 μg/mL）稀释至质量浓度100 ng/mL，将黄曲霉毒素B1内标物、黄曲霉毒素B2内标物、黄曲霉毒素G1内标物、黄曲霉毒素G2内标物储备溶液（0.5 μg/mL）稀释至质量浓度50 ng/mL，在-20 ℃下避光保存，备用；使用时用50%乙腈配制成不同浓度标准系列工作溶液（同位素内标质量浓度为2.0 ng/mL）。

1.3.2 凝胶色谱净化条件

GPC凝胶色谱净化柱（20 mm×400 mm）填料：50.0 g Bio-Beads S-X3（Bio-Rad）中性、多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球体200～400目。流动相：环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）。GPC泵流速：5.0 mL/min。样品定量环：5 mL。Forerun（除杂质时间）：0～25 min。Mainrun（收集目标物时间）：15 min。Tailing（洗柱时间）：5 min。将收集的流分再经Online EVA自动浓缩定容系统真空浓缩，温度40 ℃，2.0 mL定容，第一步浓缩的真空度为180 mbar，第二步浓缩的真空度为200 mbar。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18型（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流动相A，0.1%甲酸溶液；流动相B，乙腈；梯度洗脱见表1。柱温：30 ℃。进样量：2.0 μL。流速：0.3 mL/min。

1.3.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源ESI。扫描方式：正离子模式扫描。检测方式：多重反应监测（MRM）。干燥气温度（Gas Temp）：325 ℃。干燥气流速（Gas Flow）：5 L/min。雾化器压力（Nebulizer）：45 psi。鞘气温度（Sheath Gas Temp）：325 ℃。鞘气流速（Sheath Gas Flow）：11 L/min。毛细管电压（Capillary）：4 000 V。高纯氮气：纯度不低99.999%。采用MRM模式内标法定量，具体参数见表2。

1.3.5 样品预处理及样品测定

取2.5 g植物油样品于25 mL比色管中，加入0.10 mL混合同位素内标工作溶液，用乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）混合溶液定容至刻度，涡旋混匀1.0 min，取10 mL混合提取液至GPC进样瓶，上样5.0 mL，GPC净化。将收集的净化浓缩液经氮吹仪氮吹至近干，用1.0 mL乙腈50%溶液充分溶解，混匀后过0.22 μm有机相滤膜过滤入进样瓶，供液质联用仪，上机，并采用MassHunter工作站数据处理系统软件对所采集的数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 GPC净化条件的优化

GPC净化步骤的收集流分时间主要考虑能有效除去样品中的色素、脂肪等大分子杂质并有效收集目标化合物。试验用乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）混合溶液配制了质量浓度为50 ng/mL的黄曲霉毒素及其同位素内标物混合溶液，采用GPC泵，于流速5.0 mL/min洗脱，检测黄曲霉毒素及其同位素内标物混合溶液在不同流出时间的收集液，收集每10 mL流出液于单个样品瓶中，共收集100 mL。分别检测各段流出液中各个目标物的含量和回收率，最终确定GPC洗脱程序：除杂质时间0～25 min；收集目标物时间15 min；洗柱时间5 min。按此洗脱程序收集并浓缩后上机检测，结果显示四种黄曲霉毒素的回收率均大于90%，以此确定样品前处理为GPC方法。

2.2 色谱与质谱条件的选择

四种黄曲霉毒素及其内标物的分子结构差异不大，采用等度洗脱很难在短时间内达到分离。用Agilent ZORBAX SB-C18型（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），并分别使用不同试剂及洗脱梯度分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2及其内标化合物，结果显示，以0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相梯度洗脱，可以使待测组分在4.5 mi内实现有效分离。

采用正离子电喷雾模式（ESI+），首先对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液进行全扫描（Scan），分别找到4种黄曲霉毒素及4种同位素内标物的母离子，再选择离子检测（SIM）确定各种目标物的保留时间、优化提取电压（Fragmentor），然后通过子离子扫描方式（Product Ion Scan）找出各种目标物的子离子，找到其丰度较大的子离子，进一步优化碰撞能量（CE），以得到最佳的子离子用于定量，建立的MRM分析方法条件见表2。4种黄曲霉毒素及其同位素内标物的定量离子对串联质谱图（MRM）见图1。以多重反应监测（MRM）的扫描模式进行检测。

2.3 方法的标准曲线、检出限、回收率及精密度

对四种黄曲霉毒素混合标液进样测定，绘制标准工作曲线。并根据标准工作曲线最低浓度点的响应值进行推算，当信噪比S/N=3时对应的目标化合物含量为方法的定性检出限（LOD）。分别称取6份空白植物油样品，每份2.5 g，每2份为一组，进行10.0，40.0和80.0 μg/kg三组浓度水平的添加回收试验，重复6组平行试验，再分别加入0.1 mL混合同位素内标物质，按方法进行测定并计算4种黄曲霉毒素的回收率和相对标准偏差（RSD）。结果见表3。

图1 黄曲霉毒素总离子TIC图及其各个物质的MRM图

表3 线性方程、相关系数、检出限、回收率及精密度

2.4 样品测定

国内外对食品中黄曲霉毒素限量标准日趋严格，我国食品卫生标准GB 2761—2017规定了食品中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素M1最大限量标准，其中植物油黄曲霉毒素B1限量为：花生油和玉米油≤20 μg/kg，其他油脂≤10 μg/kg。美国、加拿大、日本等国家主要对黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）总量有限定[14]。采用此次试验建立的检测方法对20份菜籽油、花生油、玉米油、大豆油等植物油样品进行检测，其中有一份样品检出黄曲霉毒素B1、B2，含量分别为1.85和4.32 μg/kg，其他样品均未检出（小于检出限），并对该阳性样品采用GB 5009.22方法进行了方法验证，检出黄曲霉毒素B1、B2含量分别为1.60和3.08 μg/kg。结果显示该法检出黄曲霉毒素B1、B2含量高于GB 5009.22方法检出含量，图2分别为该方法（A）及GB 5009.22方法（B）检测阳性样品的总离子流TIC图。

图2 该方法（A）及GB 5009.22方法（B）检测阳性样品的总离子流TIC图

3 结论

为了更有效对食品中黄曲霉毒素污染进行监测，进一步提高黄曲霉毒素的检测手段至关重要。试验采用凝胶色谱净化对植物油样品进行前处理，建立了凝胶色谱净化-超高效液相色谱-串联质谱联用（GPCUPLC-MS/MS）测定植物油中四种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的分析方法，在质谱的正离子模式下监测，四种黄曲霉毒素及其内标化合物在4.5 min内达到有效分离，再利用同位素内标法对其定性定量分析，加标回收率大于90%，采用该法对阳性样品进行检测及并用国标方法进行验证。该方法具有简便灵敏、准确快速、重现性好、自动化程度高、杂质干扰少等优点，为植物油及其他食品中微量真菌毒素的检测及标准制修订等提供科学参考。