气相色谱法测定水产品中丙泊酚麻醉剂的残留量

颜珲璘 ，黄和 *，高平，陈日檬，曾丹丹，周凯

1. 广东海洋大学食品科技学院（湛江 524088）；2. 广东省水产品加工与安全重点实验室（湛江 524088）；3. 广东普通高等学校水产品深加工重点实验室（湛江 524088）；4. 湛江市食品药品检验所（湛江 524022）

随着生活物质水平的提高，人们对鲜活水产品的需求越来越多，为了降低水产品在运输过程中的损耗，渔用麻醉剂的使用开始广泛，但麻醉剂的残留量及其安全性问题也备受关注[1]。目前常使用的麻醉剂有CO2、MS-222、丁香酚类化合物等[2]。

丙泊酚化学名为2, 6-双异丙基苯酚[3]，该品为高脂溶性的烷基酚类的短效静脉麻醉剂，它具有麻醉诱导起效快、苏醒迅速且功能恢复完善等优点[4]，常见于医学临床使用。有研究表明，丙泊酚易引起心脏和呼吸抑制[5]。丙泊酚具有效迅速、镇静作用强的特点，其引起滥用、意外过量和自杀等案件逐年增多，特别是美国著名歌星迈克尔·杰克逊之死案件[6]，更使丙泊酚受到极大关注。

目前，关于样品中丙泊酚的分析方法有高效液相法[7]、气相色谱质谱联用法[8]、液相色谱质谱联用法[9]等。丙泊酚麻醉剂的残留量检测分析主要在血液、药品等范围，有关水产品中丙泊酚麻醉剂残留量的检测方法未见报道。试验采用分散固相萃取的样品前处理方法，对水产品中的丙泊酚麻醉剂残留量的测定方法进行研究，旨在建立一种能够测定水产品中丙泊酚麻醉剂的简单、快速、灵敏的方法，为我国水产品中丙泊酚麻醉剂残留检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南美白对虾、鳜、金鲳，洗净，去鳞、去皮，取出肌肉部分，用搅拌机搅碎，放入-18 ℃冰箱中保存，备用。

丙泊酚（CAS号2078-54-8，浓度≥99%）、内标物百里香酚（CAS号89-83-8，浓度≥99%）、无水硫酸镁（上海麦克林公司）；乙腈、甲醇、乙酸乙酯（色谱纯，Thermo Fisher公司）；无水硫酸镁（国药集团公司）；QuEchERs dSPE EMR-Lipid、EMR-polish（安捷伦公司）；ProElut PLS（150 mg/6 mL，迪马科技）；C18反相固相萃取柱（500 mg/3 mL，Thermos公司）。

1.2 仪器与设备

GC-2010 PLUS气相色谱仪（日本岛津公司）；ST-16R型高速冷冻离心机（Thermos公司）；TP-220 A型电子天平（湘仪天平仪器有限公司）；VTX-3000 L型旋涡混匀器（东京理化有限公司）；KQ-250 DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；超纯水机（Thermos公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取2.0 g（精确至0.01 g）1.1所述样品于50 mL离心管中，加入一粒均质子，加入10 mL乙酸乙酯，漩涡振荡1 min，离心机以5 000 r/min离心5 min，取出上清液于15 mL具塞离心管中，待净化。

1.3.2 净化

取EMR-Liplid dSPE分散净化管，加入5 mL水，摇匀，然后吸取5 mL上述待净化液至净化管中，漩涡振荡1 min，离心机以5 000 r/min离心3 min，将离心后的提取液移取5 mL至EMR Lipid Polish反萃取管中，漩涡混合，吸取1 mL净化液于进样小瓶中，待GC分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：HP-50+（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）。升温程序：色谱柱初温80 ℃，保持3 min，然后以15 ℃/min升温至260 ℃，保持10 min。进样口温度：230 ℃。进样方式：不分流进样。进样体积：1 μL。载气：高纯氮气（纯度≥99.999%）。流速：1.0 mL·min-1。模式：恒压。

1.5 标准溶液的配制

称取适量的丙泊酚标准品于棕色容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，在-18 ℃条件下避光保存，有效期6个月。使用时用乙酸乙酯将储备液稀释成试验所需浓度的标准工作溶液，临用现配。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

试验采用气相色谱法测定丙泊酚麻醉剂残留量。使用的溶剂主要有乙酸乙酯-丙酮（1∶1，V/V）[10]、乙酸乙酯[11]和丙酮[7]三种。将丙泊酚标准储备液，分别用乙酸乙酯-丙酮（1∶1，V/V）、乙酸乙酯和丙酮稀释成10 μg/mL，进行气相色谱检测，色谱图如图1所示。结果显示，当乙酸乙酯-丙酮（1∶1，V/V）作为溶剂时，基线不平稳，有较大干扰峰出现；当乙酸乙酯作为溶剂时，无杂峰干扰，且基线平稳；当丙酮作为溶剂时，目标峰与内标峰附近基线不平稳，影响准确定量。所以，选择乙酸乙酯为最终溶剂。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 柱温的选择

试验采用HP-50+毛细管柱，该类柱子的使用温度范围是40～280 ℃，因此柱温选择在正常使用范围内，按照温度梯度变化，选择70，80和90 ℃依次分析，色谱图见图2。结果发现，柱温的变化除了对保留时间有影响外，其对峰型不会有较大的影响，当柱温降低时，出现基线不平稳现象；当柱温升高时，峰形有拖尾现象。因此，为了考虑峰形，选择80 ℃作为试验柱温。

图1 三种不同溶剂比较色谱图

图2 不同柱温比较色谱图

2.2.2 进样口温度的设置

试验对进样口温度的考察结果如图3所示。结果表示进样口温度对峰形没有太大的影响。从不同进样口温度下相同浓度的标准物质的保留时间对比可知，不同进样口温度对保留时间也没有太大影响，考虑到仪器使用寿命，选择较低温度作为试验温度，因此选择230 ℃为进样口温度。

2.3 净化条件的选择

由于虾肉、鱼肉等水产品中含有大量的蛋白质、脂肪等物质，其基质特别复杂[12]，对于丙泊酚的净化方法报道较少，所以试验采用不同固相萃取方式进行样品净化。

2.3.1 ProElut PLS固相萃取柱净化

黄武等[13]采用ProElut PLS固相萃取柱净化，高效液相色谱法测定丁香酚类化合物。因此，在此试验基础上，尝试使用ProElut PLS的方法进行净化，其操作步骤是：样品经丙酮提取后，将上清液移至10 mL的试管中，用3 mL甲醇、水活化ProElut PLS固相萃取柱，加入3 mL试样，然后用5%的甲醇水淋洗，抽干，3 mL甲醇洗脱，洗脱液用氮吹仪吹至尽干，用乙酸乙酯复溶至1 mL，过滤膜，待气相测定。结果表明，通过PLS净化过的样品在目标峰出现的时候，无明显杂质影响，因此对其进行了加标试验，其色谱图见图4。结果显示，虽然在空白样品净化时，杂峰对样品的出峰没有明显干扰，但是在加标回收试验中，发现其在目标物和内标物出峰时间未出峰，时间略有延迟，检测到的峰不是目标峰所在保留时间，因此此方法不适用。

图3 不同进样口温度比较色谱图

图4 ProElut PLS柱加标色谱图

2.3.2 C18反相固相萃取柱净化

C18反相固相萃取柱是以强疏水性硅胶基体为吸附剂，对非极性化合物具有较好的保留性，目前较为广泛应用[14]。试验尝试使用C18反相固相萃取柱的方法进行净化，其操作步骤是：样品经丙酮提取后，将上清液移至10 mL的试管中，加入200 μL四甲基氢氧化铵，吹至尽干，然后用乙酸乙酯复溶至5 mL。将C18柱置于固相萃取装置，用5 mL甲醇、水活化，加入5 mL试样，然后用5%的甲醇水淋洗，抽干，5 mL甲醇洗脱，洗脱液用氮吹仪吹至尽干，用乙酸乙酯复溶至1 mL，过滤膜，待气相测定。结果表明，在目标峰出现的时候，无明显杂质影响，因此对其进行加标试验，其色谱图见图5。结果显示，虽然在空白样品中，杂质峰的影响很小，但是在进行加标试验后，并未出现目标峰，回收率低，无法满足检测条件，因此C18反相固相萃取柱方法不可取。

图5 C18净化加标色谱图

2.3.3 EMR-Lipid结合EMR-Polish反萃取管净化

EMR-Lipid增强型脂质去除产品和EMR-Lipid Polish反萃管具有出色的基质净化效果，能够去除大部分基质（尤其是脂质），且不会对分析物回收率造成显著影响[15]。其操作步骤是：样品经10 mL丙酮提取后，上清液待净化。取15 mL EMR-Liplid dSPE分散净化管，加入5 mL水，摇匀，然后吸取5 mL待净化液至净化管中，旋涡振荡1 min，充分混匀，离心机以5 000 r/min离心3 min，将离心后的提取液移取至EMR Lipid Polish反萃取管中，旋涡混合，吸取1 mL净化液于进样小瓶中，待气相分析。结果表明，EMR-Lipid结合EMR-Polish反萃取管净化的空白样品在目标峰出现时未有杂峰影响，因此对其进行了加标试验，其色谱图见6。结果显示，经过净化的样品目标峰、内标峰完全与杂峰分离，对其进行的加标回收试验回收率较高，经过多次加标发现其重现性较好。因此，试验选择了这种净化方式。

图6 EMR-Lipid结合EMR-Polish反萃取管加标净化加标色谱图

2.4 加标回收率

在南美白对虾、鳜、金鲳中分别添加质量浓度为1.0，2.0和10.0 μg/mL水平的标准溶液，内标物质量浓度为40.0 μg/mL，同时设置一个空白，计算丙泊酚麻醉剂的加标回收率及相对标准偏差（RSD），结果见表1。结果表明，当丙泊酚添加质量浓度为1.0～10.0 μg/mL时，其加标回收率为83.75%～102.18%，相对标准偏差为1.54%～7.39%，表明该方法的准确性和重现性好，符合残留分析要求。

表1 丙泊酚加标回收率

2.5 方法的线性范围

根据1.4色谱条件，将1.0 mg/mL的丙泊酚标准储备液用乙酸乙酯稀释成0.4，0.8，1.0，2.0，4.0，8.0和10.0 μg/mL的丙泊酚标准工作液，然后将1.0 mg/mL的百里香酚标准储备液用乙酸乙酯稀释成4.0 μg/mL的百里香酚内标标准工作液进行分析，以丙泊酚和百里香酚的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，做回归方程。结果表明，以该方法分析，丙泊酚在10.0～100.0 μg/mL质量浓度范围内其线性关系良好，线性回归方程为Y=1.198 2X-0.050 4，R2=0.999，检出限为0.3 mg/kg。

2.6 方法的重现性和稳定性

取同一浓度的丙泊酚标准溶液，共5份，分别连续进样后，根据峰面积测定，RSD值为1.3%，小于5%，表明该方法的重现性良好；同时将标准溶液置于0，3，9，12和24 h，测定其含量，RSD值为2.5%，表明该方法的稳定性良好。

3 结论

通过前处理方法的优化，样品用乙酸乙酯提取后，使用EMR-Lipid结合EMR-Polish反萃取管净化，经过0.25 μm的滤膜过滤后，用气相色谱仪检测。通过优化色谱条件，确定色谱条件为HP-50+毛细管柱，FID检测器，色谱柱温度80 ℃、进样口温度230 ℃、检测器温度280 ℃，升温程序：色谱柱初温80 ℃，保持3 min，然后以15 ℃/min，至260 ℃，保持10 min。进样模式为不分流，进样量1 μL，流速1 mL/min。水产品中丙泊酚质量浓度在0.4～10.0 μg/mL范围内线性关系良好，样品在加标质量浓度为0.4～10.0 μg/mL范围内，其平均加标回收率为83.75%～102.18%，相对标准偏差为1.54%～7.39%，检出限为0.3 mg/kg。试验所建立的检测方法适用于水产品中丙泊酚残留的测定。