液相色谱-串联质谱法测定食品中壬基酚残留

王浩，贾婧怡，于晓瑾，张杉，张旭，陈江龙

国家食品质量安全监督检验中心（北京 100094）

壬基酚（NP）是一种重要的精细化工原料和中间体，主要用于生产表面活性剂及抗氧化剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂改性剂、树脂及橡胶稳定剂等。目前，全世界壬基酚产量接近40万 t。壬基酚是一种半挥发性有机化合物，易于在不同环境中迁移，广泛存在于环境中。饲喂动物的饲料、土壤和灌溉水源都有可能受到壬基酚污染，从而导致食品中壬基酚残留。若长期食用含有壬基酚的食品，可直接干扰内分泌功能，导致性早熟、免疫力下降等，对婴幼儿的正常发育影响尤为显著。在缺少国家限量标准的情况下，相关监管部门已将其作为风险因子进行监测，且规定了婴幼儿配方乳粉中壬基酚残留临时限量值，为≤600 μg/kg。国家食品质量安全监督检验中心依据此次试验方法对国内116份常见食品（包装饮用水、植物油、液体乳、饮料、面包、饼干、畜产品、水产品、果蔬、婴幼儿配方乳粉、婴幼儿配方米粉及婴幼儿果泥等）进行检测，共检出109份阳性样品，含量为2.1～479 μg/kg，检出率为94.0%，说明壬基酚残留问题在我国食品中普遍存在。因此，为给监督执法机构提供强有力的技术支撑和依据，以便在最大程度上保护消费者健康、维护我国产品在国际市场上的地位和信誉，开发简便、快速、准确、灵敏度高且适用于常见食品类的壬基酚残留国家标准检测方法具有重大的现实意义。

目前，测定壬基酚残留的文献比较多，方法主要是气相色谱-质谱法[1-3]、高效液相色谱法[4-6]和液相-质谱联用法[7-9]等。此次试验针对不同食品基质特点，对样品提取、净化，色谱、质谱条件进行优化，建立了灵敏度高、操作简单且适用于各类食品中壬基酚残留的准确定性、定量分析方法。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

甲醇、乙腈（色谱纯，德国Fisher公司）；壬基酚、3, 5, 3-壬基酚-13C6（≥99%，Dr. Ehrenstorfer公司）；试验所选用样品为国家食品质量安全监督检验中心检验样品；其他试剂均为国产分析纯。

Agilent 6410型串联三重四极杆质谱仪，配Agilent 1200型液相色谱仪（美国Agilent公司）；GL-16G-II型离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-5200型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q去离子水发生器（美国Milli-Q公司）。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：准确称取10.0 mg（精确至0.1 mg）4-壬基酚标准品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为200 mg/L的标准储备液，于-18 ℃保存，存效期为6个月。

同位素内标标准储备液：准确称取10.0 mg（精确至0.1 mg）3, 5, 3-壬基酚-13C6标准品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为200 mg/L的标准储备液，于-18 ℃保存，存效期为6个月。

标准中间液：准确吸取0.5 mL标准储备液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1.0 mg/L的标准中间液，于-18 ℃保存，存效期为3个月。

同位素内标中间液：准确吸取0.5 mL同位素内标标准储备液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1.0 mg/L的同位素内标中间液，于-18 ℃保存，存效期为3个月。

标准系列工作液：分别准确吸取10，20，50，100，200和1 000 μL标准中间液，以及200 μL同位素内标中间液，用乙腈稀释并定容至10 mL。壬基酚质量浓度依次为1.00，2.00，5.00，10.0，20.0和100 ng/mL，标准工作液中3, 5, 3-壬基酚-13C6质量浓度为20 ng/mL。现配现用。

包装饮用水壬基酚标准系列工作液质量浓度配制为0.025，0.050，0.10，0.20，0.50和1.0 ng/mL，标准工作液中3, 5, 3-壬基酚-13C6质量浓度为20 ng/mL。现配现用。

1.3 色谱和质谱分析条件

1.3.1 色谱分析条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18柱，1.9 μ m，4.6 mm×50 mm，配备预柱。流速0.35 mL/min，柱温25 ℃，进样量3 μL（包装饮用水样品，进样量50 μL）。流动相，甲醇-水（10∶90，V/V）。

1.3.2 质谱分析条件

离子源，电喷雾离子源（ESI）；扫描方式，负离子模式；检测方式，多反应监测；干燥气，N2；雾化气压力，413.8 kPa；干燥气温度，340 ℃；干燥气流速，8 L/min。

1.4 样品处理

包装饮用水：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样，加入20.0 μL同位素内标中间液，涡旋振荡10 s，液相色谱-串联质谱测定。

液体乳、果汁等液态饮品：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样，置于5 mL玻璃离心管中，加入20.0 μL同位素内标中间液，涡旋振荡10 s后，再加入乙腈3.0 mL（酸奶、果汁等酸性样品加入2%氨水乙腈），加塞后剧烈振摇1 min左右，超声提取10 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃条件下以15 000 r/min离心5 min（如需要，可再离心1次），液相色谱-串联质谱测定。

油脂类食品：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样（固态试样需60 ℃水浴液化），置于5 mL玻璃离心管中，加入20.0 μL同位素内标中间液，涡旋振荡10 s后，再加入3.0 mL乙腈，加塞后用手剧烈振摇1 min左右，静置30 min，待分层后，吸取1 mL上清液，在4 ℃条件下以15 000 r/min离心5 min（如需要，可再离心1次），液相色谱-串联质谱测定。

面包、饼干、大米、面条等谷物及其制品：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样，置于10 mL玻璃离心管中，加入20.0 μ L同位素内标中间液，再加入4.0 mL 70%乙腈水溶液（面包样品加入6.0 mL），涡旋振荡30 s后，超声提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃条件下以15 000 r/min离心5 min（如需要，可再离心1次），液相色谱-串联质谱测定。

猪肉、鱼肉等动物源性食品：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样，置于5 mL玻璃离心管中，加入20.0 μL同位素内标中间液，再加入4.0 mL乙腈，涡旋振荡10 s后，超声提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃条件下以15 000 r/min离心5 min（如需要，可再离心1次），液相色谱-串联质谱测定。

胡萝卜、苹果等果蔬类食品：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样，置于5 mL玻璃离心管中，加入20.0 μL同位素内标中间液，再加入3.0 mL乙腈（苹果等酸性水果样品加入2%氨水乙腈），涡旋振荡10 s后，超声提取30 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃条件下以15 000 r/min离心5 min（如需要，可再离心1次），液相色谱-串联质谱测定。

乳粉（含婴幼儿配方乳粉）：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样，置于10 mL玻璃离心管中，依次加入20.0 μL同位素内标中间液和2.0 mL 50 ℃左右热水，涡旋振荡10 s后，再加入4.0 mL乙腈，加塞后剧烈振摇至蛋白质沉淀，超声提取10 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃条件下以15 000 r/min离心5 min（如需要，可再离心1次），液相色谱-串联质谱测定。

米粉（含婴幼儿配方米粉）：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样，置于10 mL玻璃离心管中，加入20.0 μL同位素内标中间液，再加入6.0 mL 50%乙腈水溶液，涡旋振荡30 s后，超声提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃条件下以15 000 r/min离心5 min（如需要，可再离心1次），液相色谱-串联质谱测定。

婴幼儿营养果泥：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样，置于5 mL玻璃离心管中，加入20.0 μL同位素内标中间液，再加入3.0 mL 2%氨水乙腈，涡旋振荡10 s后，超声提取30 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃条件下以15 000 r/min离心5 min（如需要，可再离心1次），液相色谱-串联质谱测定。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件选择

壬基酚是一种重要的精细化工原料和中间体，不溶于水，略溶于石油醚，溶于丙酮、四氯化碳、乙腈、乙醇和氯仿。在该方法所适用的食品基质范围内，蛋白质组分对壬基酚提取、检测产生最大干扰，比较上述这几种有机试剂的除蛋白效果，发现乙腈既能有效提取壬基酚，又能去除样品中蛋白质，其余几种去除蛋白效果不好，所以采用乙腈超声提取目标化合物。经试验发现，对壬基酚进行减压旋蒸浓缩和氮吹浓缩时，目标化合物低浓度时重现性比较差，所以不宜采取浓缩富集处理。由于食品基质成分比较复杂，且普遍存在油脂成分，所以样品前处理通常采用化学除油、过膜等净化步骤。经大量试验发现，很多溶剂（正己烷、乙酸乙酯等）、固相萃取柱、各种QuEChERS填料、各种滤膜均有壬基酚残留，所以该方法不采用除油和过膜处理，最终采用4 ℃条件下以15 000 r/min后直接进样。同时通过大量试验优化，最终确定3 μL进样量，且该方法规定色谱柱需要配保护预柱，这样极大减小了测定液中杂质对色谱柱的不良影响。标准起草单位用这种前处理方法每年完成3 000批次左右的壬基酚检测任务，均未发现对色谱柱和质谱有不良影响。

2.2 色谱条件选择

2.2.1 色谱柱的选择

该方法分别采用资生堂MGⅢ-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μ m）、Hypersil GOLD C18色谱柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）和Agilent Extend-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）进行分离试验，发现Hypersil GOLD C18色谱柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）峰形及出峰时间较为合适。

2.2.2 流动相的选择

壬基酚为中等极性化合物，为了利于色谱峰的分离及峰型的改善，该方法的流动相首先采用梯度洗脱，结果发现以空白试剂为样品会出现假阳性的情况。经过反复试验，确定采用等度洗脱，流动相为甲醇-水（10∶90，V/V）；流速为0.35 mL/min，出峰时间在4 min左右，5 min能完成1次样品测定。结果见图1。

图1 壬基酚及其同位素内标的MRM 色谱图

2.2.3 进样量选择

为了减少测定液中杂质对色谱柱影响，且确保目标物的出峰时间、峰型、响应强度达到最优状态，采用进样3 μL、配保护预柱。针对包装饮用水样品，为了提高样品中壬基酚的检出限，选择进样50 μL。

2.3 同位素内标选择

试验分别选取了氘代4-正-壬基酚和碳13标记3,5, 3-壬基酚作为内标进行对比研究。具有直链结构的氘代4-正-壬基酚，其碎片离子质荷比为112，标准品4-壬基酚的碎片离子质荷比分别为132.9和147。因此，二者母离子碎裂方式可能不同，且液相保留时间也不相同。这可能会造成目标化合物在离子源中的离子化效率不同而影响定量结果。具有支链结构内标（碳13标记3, 5, 3-壬基酚）的碎片离子与标准品4-壬基酚相同。所以碳13标记的3, 5, 3-壬基酚可以更好地校正测定过程对目标化合物的影响，更适合作4-壬基酚混合物标准品的内标。

2.4 质谱条件优化

采用直接进样方式分别将质量浓度为100 ng/mL的壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6注入离子源中，在负离子扫描模式下进行母离子全扫描，得到壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的分子离子峰，分别为219.2和225.2。根据欧盟2002/657/EC指令规定对于质谱确证方法必须达到4个确证点的要求，低分辨液相色谱-质谱联用仪检测应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子。以该离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，最后采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，然后再对得到的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳，得到壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的最佳质谱参数。壬基酚在碰撞能量分别为30和20 eV时，m/z132.9和m/z147.0碎片离子的强度比较大，因此选择这两个离子作为定量及定性的检测离子。3, 5,3-壬基酚-13C6在碰撞能量为35 eV时，m/z139.1碎片离子的强度比较大，因此选择这个离子作为定量检测离子，结果见表1。

2.5 线性关系、检出限及定量限

用标准系列工作液，分别进样3 μL（包装饮用水样品，进样量50 μL），测定结果经线性回归（y为峰面积，Counts；x为质量浓度，μg/L），同时用选择空白样品，定量添加标准溶液，按照方法中介绍的步骤操作，当所得谱图的信噪比大于3时，将此添加量定为最低检出限；当信噪比大于10时，将此添加量定为最低定量限，结果见表2。

表1 壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的质谱参数

表2 壬基酚的线性方程、线性范围、相关系数检出限及定量限

2.6 方法的回收率和精密度

分别选取具有代表性的样品进行回收率与精密度试验。准确称取包装饮用水、椰汁、植物油、饼干、鱼肉、苹果、婴幼儿配方乳粉、婴幼儿配方米粉、婴幼儿营养果泥等典型样品各6份，每份1.0 g，共3组，分别定量加入4-壬基酚标准物质和内标物，因为考虑到很难找到阴性样品，为了更好考察方法的回收率与精密度，加标水平分别设定为10，20和100 μ g/kg，按样品前处理进行测定。试验结果表明，不同浓度平均加标回收率为86.0%～114.3%，平均相对标准偏差为2.8%～9.5%（n=6）。

表4 典型样品基质中壬基酚的加标回收率和精密度

接表4

2.7 实际样品检测

使用该方法对市售的116份食品进行了检测，共检出109份阳性样品，含量为2.1～479 μg/kg，检出率为94.0%，其中婴幼儿配方乳粉残留量较高，但含量未超出我国临时限量值（≤600 μ g/kg）。上述结果表明，我国食品中确实存在壬基酚残留，其对消费者健康存在的风险应当引起重视。

3 结论

根据实际样品检测数据，发现婴幼儿营养乳粉中壬基酚的检出率较高，考虑到婴儿配方乳粉是0～6个月龄的婴儿的唯一食物来源，长期食用含有壬基酚的乳粉对婴儿的危害是极为显著的，必须引起高度重视。此次试验所建立的高效液相色谱-质谱联用方法，实现了食品壬基酚残留准确测定，该方法为相关执法监督和食品生产企业质量控制提供科学依据，为我国的食品质量安全工作给予技术支持。